申冬妮,楊建云,肖炳坤,黃榮清

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所,北京 100850)

·藥物制劑與藥品質(zhì)量控制·

3-酰胺基-吲哚類(lèi)衍生物及其有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定*

申冬妮,楊建云,肖炳坤,黃榮清

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所,北京 100850)

目的 建立反相高效液相色譜法測(cè)定3-酰胺基-吲哚類(lèi)衍生物及其有關(guān)物質(zhì)含量。方法采用Diamonsil C18(250mm×4.6mm,5μm)色譜柱,流動(dòng)相為甲醇∶乙腈∶水(43∶12∶45),流速1.0mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)224 nm;進(jìn)樣量20μL;柱溫:室溫。結(jié)果3-酰胺基-吲哚類(lèi)衍生物與有關(guān)物質(zhì)能達(dá)到較好分離,在0.04～0.16 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好,r=0.999 7;方法重復(fù)性RSD為0.52%;檢測(cè)限為2.65 ng。結(jié)論該方法準(zhǔn)確可靠,靈敏度高,專屬性好,可用于3-酰胺基-吲哚類(lèi)衍生物及其有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定。

3-酰胺基-吲哚類(lèi)衍生物;色譜法,高效液相;含量測(cè)定

抑郁癥是一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)身心健康的常見(jiàn)精神疾病,主要表現(xiàn)為情緒低落,興趣喪失,思維遲鈍,意志行為減少,嚴(yán)重者伴有自殺觀念和行為。當(dāng)前世界十大疾病中,抑郁癥名列第五位,其患病率已經(jīng)超過(guò)了人們認(rèn)為很常見(jiàn)的咽喉炎和冠心病,而且預(yù)計(jì)到2020年將躍升到第二位[1-2]。3-酰胺基-吲哚類(lèi)衍生物為本所合成的褪黑素類(lèi)衍生物,可以增加褪黑素受體親和性,有抗抑郁的作用。筆者建立了簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的高效液相色譜(HPLC)分析方法,用于測(cè)定3-酰胺基-吲哚類(lèi)衍生物含量及其有關(guān)物質(zhì),為其質(zhì)量的可控奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695-2996高效液相色譜儀(四元泵,二極管陣列檢測(cè)器,自動(dòng)進(jìn)樣器,Empower色譜工作站)。

1.2 試藥 甲醇和乙腈均為色譜純,水為娃哈哈純凈水。3-酰胺基-吲哚類(lèi)衍生物對(duì)照品(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所自制,含量:99.6%)；3-酰胺基-吲哚類(lèi)衍生物供試品(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所自制,批號(hào)分別為20121011,20121015, 20121018)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液 取3-酰胺基-吲哚類(lèi)衍生物對(duì)照品約20 mg,精密稱定,置50 m L量瓶中,加適量流動(dòng)相超聲助溶,冷卻至室溫,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2 對(duì)照品溶液 取對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL至10 mL量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度搖勻,作為對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品儲(chǔ)備液 取3-酰胺基-吲哚類(lèi)衍生物供試品約10 mg,精密稱定,置25 m L量瓶中,加適量流動(dòng)相超聲助溶,冷卻至室溫,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為供試品儲(chǔ)備液。

2.1.4 供試品溶液 取供試品儲(chǔ)備液2 mL至10 mL量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度搖勻,作為供試品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 采用Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色譜柱；流動(dòng)相:甲醇-乙腈-水(43∶12∶45)；檢測(cè)波長(zhǎng)224 nm；流速1.0 m L·min-1；進(jìn)樣量20μL；柱溫:室溫。理論板數(shù)以3-酰胺基-吲哚類(lèi)衍生物計(jì)算不低于5 000。

按上述色譜條件,將對(duì)照品溶液、供試品溶液各20μL分別進(jìn)樣,3-酰胺基-吲哚類(lèi)衍生物的保留時(shí)間約為14 min,主峰與有關(guān)物質(zhì)峰能得到良好分離(R＞1.5)。見(jiàn)圖1。

A.3-酰胺基-吲哚類(lèi)衍生物對(duì)照品;B.3-酰胺基-吲哚類(lèi)衍生物供試品;1.3-酰胺基-吲哚類(lèi)衍生物圖1 兩種溶液的HPLC色譜圖A.3-amido-indole derivative control solution；B.sample solution of 3-amido-indole derivatives；1.3-amido-indole derivativesFig.1 HPLC chromatogram of two solutions

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,4.0 mL置10 mL量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度搖勻,得一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取20μL進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖[3]。以峰面積(A)為縱坐標(biāo),以濃度(C,mg·mL-1)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程(n=7):A=1×108C-4.18×104,r=0.999 7。結(jié)果表明,3-酰胺基-吲哚類(lèi)衍生物在0.04～0.16 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性。

2.3.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別取供試品(批號(hào): 20121011)6份及對(duì)照品2份,精密稱定,照“2.2”項(xiàng)操作,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品含量,含量分別為100.8%,101.3%,101.5%,101.4%,102.0%, 101.5%,平均含量為101.3%,RSD為0.52%。

2.3.3 檢測(cè)限與定量限 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)對(duì)照品儲(chǔ)備液,加流動(dòng)相逐級(jí)稀釋,進(jìn)樣,記錄色譜圖,在信噪比(S/N)為3∶1時(shí)測(cè)得檢測(cè)限為2.65 ng,在S/N為10∶1時(shí)測(cè)得的定量限為10.6 ng。

2.3.4 樣品含量測(cè)定 按“2.1”項(xiàng)的方法分別制備對(duì)照品溶液和供試品溶液,各取20μL進(jìn)樣,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品含量,結(jié)果表明,3批樣品主峰含量均＞99.0%(表1)。

表1 3批樣品的含量及有關(guān)物質(zhì)測(cè)定Tab.1 Content determ ination and related substances of 13 batches of sam p les %,n=3

2.3.5 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定 取“2.1.3”項(xiàng)的供試品儲(chǔ)備液,精密移取此溶液適量,用流動(dòng)相稀釋100倍,得自身對(duì)照溶液。以不加校正因子主成分自身對(duì)照法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的含量。結(jié)果表明,有關(guān)物質(zhì)均＜1%(表1)。

2.3.6 方法專屬性考察

2.3.6.1 酸破壞 取“2.1.3”項(xiàng)供試品儲(chǔ)備液2 mL置10 mL量瓶中,加1 mol·L-1鹽酸3 mL,靜置15 h,用1 mol·L-1氫氧化鈉中和,加流動(dòng)相稀釋至刻度搖勻,作為酸破壞樣品,照“2.2”項(xiàng)色譜條件,取20μL進(jìn)樣,記錄色譜圖。見(jiàn)圖2。

2.3.6.2 堿破壞 取“2.1.3”項(xiàng)供試品儲(chǔ)備液2 mL置10 mL量瓶中,加1 mol·L-1氫氧化鈉3 mL,靜置17 h,用1 mol·L-1鹽酸中和,加流動(dòng)相稀釋至刻度搖勻,作為堿破壞樣品,照“2.2”項(xiàng)色譜條件,取20μL進(jìn)樣,記錄色譜圖。見(jiàn)圖3。

2.3.6.3 氧化破壞 取“2.1.3”項(xiàng)下供試品儲(chǔ)備液2 mL置10mL量瓶中,加30%過(guò)氧化氫溶液3mL,靜置12 h,加流動(dòng)相稀釋至刻度搖勻,作為氧化破壞樣品,照“2.2”項(xiàng)的色譜條件,取20μL進(jìn)樣,記錄色譜圖。見(jiàn)圖4。

1.3-酰胺基-吲哚類(lèi)衍生物圖2 供試品溶液酸破壞實(shí)驗(yàn)的HPLC色譜圖1.3-amido-indole derivativesFig.2 HPLC chromatogram of the sam p le solution in acid damage experim ent

1.3-酰胺基-吲哚類(lèi)衍生物圖3 供試品溶液堿破壞實(shí)驗(yàn)的HPLC色譜圖1.3-amido-indole derivativesFig.3 HPLC chromatogram of the sam p le solution in base damage experim ent

2.3.6.4 高溫破壞 取供試品適量,平鋪于干凈的稱量瓶?jī)?nèi),敞口放置于120℃烘箱內(nèi),3 h后取出放至室溫,稱取供試品10 mg,精密稱定,置25 mL量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度搖勻,作為高溫破壞樣品,照“2.2”項(xiàng)的色譜條件,取20μL進(jìn)樣,記錄色譜圖。見(jiàn)圖5。

結(jié)果表明供試品經(jīng)酸、堿、氧化、高溫破壞后,所建立的高效液相色譜法能夠使3-酰胺基-吲哚類(lèi)衍生物與有關(guān)物質(zhì)較好分離,說(shuō)明該方法專屬性好。

3 討論

3.1 波長(zhǎng)的選擇 經(jīng)二極管陣列全波長(zhǎng)掃描,得主峰的最大吸收波長(zhǎng)為224.0 nm,有關(guān)物質(zhì)的最大吸收在225.2 nm,因此選擇224 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.3-酰胺基-吲哚類(lèi)衍生物圖4 供試品溶液氧化破壞實(shí)驗(yàn)的HPLC色譜圖1.3-amido-indole derivativesFig.4 HPLC chromatogram of the sample solution in oxidative damage experiment

1.3-酰胺基-吲哚類(lèi)衍生物圖5 供試品溶液高溫破壞實(shí)驗(yàn)的HPLC色譜圖1.3-amido-indole derivativesFig.5 HPLC chromatogram of the sam p le solution in high temperature damage experiment

3.2 流動(dòng)相的選擇 考察了甲醇-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相,在甲醇∶水=55∶45時(shí),主藥與有關(guān)物質(zhì)分離良好,但在此條件下考察高溫破壞樣品時(shí),主峰與新破壞出的雜質(zhì)峰未分開(kāi),為縮短分析時(shí)間及改善分離度,加入乙腈進(jìn)行調(diào)節(jié),經(jīng)摸索進(jìn)行比例調(diào)節(jié),最終確定甲醇、乙腈和水的比例為43∶12∶45。

[1] 王祖承.精神病學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002: 112-125.

[2] KENNEDY SH.A review of antidep ressant treatments today [J].Eur Neuro Pharm,2006,165(4):619-624.

[3] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄195.

DOI 10.3870/yydb.2014.05.031

Determination of Contents 3-amide-indole Derivative and Related Substances

SHEN Dong-ni,YANG Jian-yun,XIAO Bing-kun,HUANG Rong-qing
(Institute of Radiation Medicine, Academy ofMilitary Medical Science,Beijing 100850,China)

ObjectiveTo establish a RP-HPLC method for the determination of 3-amide-indole derivative and its related substances.MethodsDiamonsil C18(250 mm×4.6mm,5μm)column was adopted.Themobile phase consisted of a mixture ofmethanol-acetonitrile-water(43∶12∶45)at the flow rate of 1.0 mL·m in-1.The wavelength for ultraviolet detection was 224 nm.The injection volume was 20μL and the column temperature was room temperature.Results3-amide-indole derivative and related substances could be well separated.The linearity of the 3-amide-indole derivative curve waswell correlated (r=0.999 7)within the range of 0.04-0.16 mg·mL-1.The RSD was 0.52%with good repeatability.The detection limitwas 2.65 ng.ConclusionThemethod is accurate,reliable,sensitive and specific,which can be used for the determination of 3-amide-indolederivative and related substances.

3-amide-indole derivative;Chromatography,high performance liquid;Contents determination

R971.43;R927.2

A

1004-0781(2014)05-0650-03

2013-03-05

2013-05-07

*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81072613)；“十二五”國(guó)家科技重大專項(xiàng)“重大新藥創(chuàng)制”綜合性新藥研究開(kāi)發(fā)技術(shù)大平臺(tái)(2012ZX09301003-001-010)

申冬妮(1980-),女,山西太原人,主管藥師,在讀碩士,研究方向:藥物分析。電話:(0)18190690827,E-mail:sdn2005@gmail.com。

黃榮清(1965-),男,江西人,研究員,研究方向:新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電話:010-66930217,E-mail:huangrq@tom.com。