王勇,劉曉鋒

(1.湖北省松滋市人民醫(yī)院藥劑科,松滋 434200;2.湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院,武漢 430064)

小兒柴桂退熱糖漿藥效學(xué)研究

王勇1,劉曉鋒2

(1.湖北省松滋市人民醫(yī)院藥劑科,松滋 434200;2.湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院,武漢 430064)

目的 觀察小兒柴桂退熱糖漿的解熱、抗炎、抗病毒作用。方法通過大鼠干酵母致發(fā)熱模型觀察小兒柴桂退熱糖漿解熱作用,通過小鼠巴豆油致耳廓腫脹模型觀察小兒柴桂退熱糖漿抗炎作用,通過細(xì)胞培養(yǎng)法觀察小兒柴桂退熱糖漿體外抗病毒作用。結(jié)果小兒柴桂退熱糖漿能降低酵母所致發(fā)熱大鼠第4至第6小時時間點體溫升高值,降低巴豆油致小鼠耳廓的腫脹度,對感染甲型流感病毒的狗腎傳代細(xì)胞(MDCK細(xì)胞)具有保護(hù)作用。結(jié)論小兒柴桂退熱糖漿具有解熱、抗炎、抗病毒作用。

小兒柴桂退熱糖漿;解熱作用;抗炎作用;抗病毒作用

小兒柴桂退熱糖漿主要由柴胡、桂枝、葛根、浮萍、黃芩、白芍、蟬蛻等中藥組成,是根據(jù)小兒柴桂退熱顆粒改變劑型的新藥,具有發(fā)汗解表、退熱的功效。小兒柴桂退熱顆粒主要用于小兒外感發(fā)熱、頭身痛、流涕、口渴、咽紅、溲黃、便干等癥狀,對其解熱、抗炎、抗病毒作用鮮有報道。筆者在本實驗中通過動物實驗,對小兒柴桂退熱糖漿的解熱、抗炎、抗病毒作用進(jìn)行驗證。

1 材料與方法

1.1 動物 斯?jié)姽瘛ざ嗬?Sprague Danley,SD)大鼠,SPF級,雌雄各半,體質(zhì)量170～190 g,由武漢大學(xué)動物實驗中心提供,生產(chǎn)合格證號:SCXK(鄂)2008-0004,湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院動物實驗設(shè)施使用合格證號:SYXK(鄂)2008-0009。昆明小鼠,SPF級,雌雄各半,體質(zhì)量18～19 g,由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司提供,生產(chǎn)合格證號:SCXK(鄂) 2008-0003。湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院動物實驗設(shè)施使用合格證號:SYXK(鄂)2008-0003,湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院動物實驗設(shè)施使用合格證號:SYXK(鄂)2008-0009。

1.2 試藥及其制備 受試物小兒柴桂退熱糖漿,湖北襄陽隆中藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供,批號:20110101,規(guī)格:每支10 mL。人擬臨床最大用量為80 mL·d-1,兒童(7～14歲)體質(zhì)量按30kg計,用量為2.65 mL·kg-1,相當(dāng)于生藥量1.33 g·kg-1(1 mL糖漿含生藥0.5 g)。臨用前純化水配制成高、中、低劑量的稀釋液。陽性對照藥物阿司匹林由沈陽奧吉娜藥業(yè)有限公司提供,規(guī)格:每片100 mg,批號:120404,臨用前研缽研細(xì),用純化水配制成7.4 mg·mL-1混懸液;吲哚美辛片,商品名:消炎痛,臨汾奇林藥業(yè)有限公司生產(chǎn),規(guī)格:每片25 mg,批號:1102071,臨用前純化水配制成0.283 mg·mL-1;利巴韋林注射液,湖北天藥藥業(yè)股份有限公司,規(guī)格:1 mL∶0.1 mg。造模藥物干酵母片,安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司提供,規(guī)格:每片0.2 g,批號:110705;20%干酵母混懸液的制備:取干酵母10 g,逐漸加入純化水磨為均勻的懸漿,定容至50 mL即得;巴豆油為本實驗室從巴豆藥材提取的揮發(fā)油部分。最低必需培養(yǎng)液(Eagle's minimumessential medium, EMEM)細(xì)胞培養(yǎng)基,GIBCO,批號:6721953;四甲基偶氮唑鹽(methylthiazolyl tetrazolium,MTT);Duchefa,批號:BS0880;胎牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司,批號:101207。狗腎傳代細(xì)胞(Madin-Darby Canine Kidney,MDCK細(xì)胞,傳第3代后使用),甲型流感病毒,均由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供。

1.3 儀器 XB-8656型電子體溫計,無錫新中瑞嬰兒用品有限公司;ML303型電子分析天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司制造;動物秤MJ5102電子秤,余姚紀(jì)銘稱重校驗設(shè)備有限公司;DS-671型電子秤,上海寺岡電子有限公司制造。

1.4 對酵母所致發(fā)熱大鼠體溫的影響 取SD大鼠70只,電子體溫計肛門測量體溫(溫度計插入肛門2 cm),每天測體溫2次(間隔1 h),連續(xù)3 d,選取每天體溫變化不超過0.5℃的大鼠60只,按體質(zhì)量隨機均分為6組,分別為正常對照組(不造模,給純化水),模型對照組(造模,給純化水),陽性對照組,受試物高、中、低劑量組,因體溫可前后對照,故不設(shè)空白對照組[1]。各組每天灌胃給藥2次,連續(xù)3 d,正常對照組純化水(13.3 mL·kg-1),模型對照組純化水(13.3 mL·kg-1),陽性對照組(阿司匹林, 200 mg·kg-1,13.3 mL·kg-1),受試物高、中、低劑量組(劑量分別為26.5,13.3,6.6 mL·kg-1,相當(dāng)于生藥量13.3,6.6,3.3 g·kg-1,相當(dāng)小兒擬臨床用量的10,5,2. 5倍劑量)。于給藥第3天致熱。致熱前測體溫2次,取平均值作為大鼠基礎(chǔ)體溫。各組大鼠背部皮下注射20%干酵母混懸液7.5 mL·kg-1,致熱后按前述劑量各組給藥。測量給藥后1～6 h大鼠體溫,每小時1次。計算不同時間點大鼠體溫升高值(不同時間點大鼠體溫與基礎(chǔ)值的差值)[2]。

比較模型對照組與正常對照組大鼠體溫升高情況,判斷大鼠發(fā)熱模型是否成功。同時在各時間點,分析模型對照組的體溫升高值與陽性對照組和受試物高、中、低劑量組的差異顯著性,統(tǒng)計采用ONE-WAY ANOVA法,方差齊性采用LSD多重分析,方差不齊采用Dunnett's T3多重分析[3]。

1.5 對巴豆油致小鼠耳廓腫脹的影響 取小鼠50只,隨機分為5組,分別為陰性對照組、陽性對照組和受試物高、中、低劑量組,每組10只。各組每天灌胃給藥2次,連續(xù)7 d,陽性對照組僅最后2 d給藥。陰性對照組給予純化水(26.5 mL·kg-1),陽性對照組(吲哚美辛, 7.5 mg·kg-1,26.5 mL·kg-1),受試物高、中、低劑量組(劑量分別為53.0,26.5,13.3 mL·kg-1,相當(dāng)于生藥量26.5,13.3,6.6 g·kg-1,相當(dāng)人擬臨床用量的20,10,5倍劑量)。末次給藥后1 h,將2%巴豆油(巴豆油2%,無水乙醇20%,乙醚78%)0.05 mL涂在小鼠右耳前后兩面致炎,致炎后4 h將小鼠處死,用直徑9 mm打孔器在小鼠左右耳相同部位打下耳片,用電子天平稱質(zhì)量。記錄左右耳片質(zhì)量,計算腫脹度。

腫脹度(mg)=右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量,耳廓腫脹抑制率(%)=(陰性對照組耳廓腫脹度均值-給藥組耳廓腫脹度均值)/陰性對照組耳廓腫脹度均值× 100%。

分別分析陰性對照組的腫脹度與陽性對照組、受試物高、中、低劑量組的差異顯著性,統(tǒng)計方法采用ONE-WAY ANOVA,方差齊性采用LSD多重分析,方差不齊采用Dunnett's T3多重分析[4]。

1.6 體外抗甲型流感病毒作用(無菌條件下)

1.6.1 細(xì)胞的培養(yǎng) 取受試物溶液,用EMEM培養(yǎng)液按2,4,6,8,10,20,40倍稀釋作為受試濃度,用孔徑0.22 μm濾膜無菌過濾處理。將對數(shù)生長期的MDCK細(xì)胞稀釋成含細(xì)胞1×106個·mL-1濃度,按每孔0.1 mL接種于96個孔板。培養(yǎng)24 h,貼壁完整后除去培養(yǎng)液,加入上述各稀釋度的受試物0.1 mL,每濃度重復(fù)6孔,另設(shè)空白及陰性對照組。繼續(xù)培養(yǎng)72 h,觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)(與對照組比較),選擇最大無細(xì)胞毒劑量(稀釋度),作為最大受試劑量(濃度)[5]。

1.6.2 病毒原液對MDCK細(xì)胞的半數(shù)致細(xì)胞病變劑量(tissue culture infective dose,TCID50) 將病毒原液用D-Hank's液(Sigma公司提供)按10-1,10-2,10-3, 10-4,10-5,10-6梯度稀釋,將對數(shù)生長期的MDCK細(xì)胞稀釋成含細(xì)胞1×106個·mL-1,按每孔0.1 mL接種于96個孔板。培養(yǎng)24 h,貼壁完整后除去培養(yǎng)液,加入上述各稀釋度的病毒液0.1 mL,每組重復(fù)8孔,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,觀察各孔細(xì)胞病變程度。采用SPSS15.0版統(tǒng)計軟件計算半數(shù)致細(xì)胞病變劑量TCID50[6]。

1.6.3 受試物對甲型流感病毒致MDCK細(xì)胞病變的保護(hù)作用 將6,8,10,20,40倍稀釋梯度的受試溶液分別與100倍50%組織細(xì)胞感染量(100 TCID50)病毒液等量混合,陽性對照物為0.5 mg·mL-1的利巴韋林EMEM培養(yǎng)液稀釋液,陰性對照為EMEM培養(yǎng)液,分別與100 TCID50病毒液等量混合(0.5 mL+ 0.5 mL),37℃中和30 min。將對數(shù)生長期的MDCK細(xì)胞稀釋成1×106個·mL-1,按每孔0.1 mL接種于96個孔板,培養(yǎng)24 h,貼壁完整后除去培養(yǎng)液,分別取0. 1 mL加入上述中和液,每組重復(fù)6孔,另設(shè)細(xì)胞空白組,共8組。37℃,CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h,MTT法檢測各孔吸光度值(ELX800型酶標(biāo)儀,Biotek)[7]。

受試物各劑量組、陽性對照組、空白組吸光度分別與陰性對照組吸光度比較,采用SPSS15.0版統(tǒng)計軟件,統(tǒng)計采用ONE-WAY ANOVA法,方差齊性采用LSD多重分析,方差不齊采用Tamhane多重分析[8]。

2 結(jié)果

2.1 對酵母所致發(fā)熱大鼠體溫的影響 不同時間點大鼠體溫升高值見表1,模型對照組較正常對照組大鼠第2～第6小時體溫升高(P＜0.05或P＜0.01),表明造模成功。與模型對照組比較,陽性對照組第2～第6小時體溫升高值降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05),受試物中劑量組第4～第6小時體溫升高值降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),說明小兒柴桂退熱糖漿能降低酵母所致發(fā)熱大鼠的體溫,具有解熱作用[9]。

2.2 對巴豆油致小鼠耳廓腫脹的影響 各組藥物對巴豆油致小鼠耳廓腫脹的影響結(jié)果見表2。陽性對照組,受試物高、中、低劑量組耳廓腫脹度低于陰性對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05),表明小兒柴桂退熱糖漿能抑制巴豆油致小鼠耳腫脹作用,說明小兒柴桂退熱糖漿具有抗炎作用[10]。

2.3 體外抗甲型流感病毒作用 受試物2,4倍稀釋液無法通過孔徑0.22 μm濾膜,故選擇6,8,10,20,40倍稀釋液實驗,各稀釋液對細(xì)胞的生長均無影響,最大無細(xì)胞毒劑量(稀釋度)為6倍,受試藥體外抗甲型流感病毒作用濃度選擇為6,8,10,20,40倍稀釋液。經(jīng)實驗,病毒TCID50=10-4.7,100 TCID50=1/500,故選擇1/500倍病毒稀釋液進(jìn)行。陽性對照組、受試物6, 8,10倍稀釋劑量組吸光度值明顯高于陰性對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,說明細(xì)胞存活度明顯高于陰性對照組,20,40倍稀釋劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,空白組與陰性組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,對感染甲型流感病毒的MDCK細(xì)胞具有保護(hù)作用。結(jié)果見表3,提示小兒柴桂退熱糖漿體外有抗甲型流感病毒作用[11]。

表1 6組大鼠不同時間體溫測定結(jié)果 n=10

表2 5組小鼠耳廓腫脹度與腫脹抑制率測定結(jié)果 n=10

實驗表明,受試物稀釋劑6,8,10倍量具有體外抗甲型流感病毒作用。

表3 8組吸光度值測定結(jié)果 ±s

表3 8組吸光度值測定結(jié)果 ±s

與陰性對照組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01

組別細(xì)胞孔數(shù)吸光度值空白組60.901±0.079*1陰性對照組60.110±0.024陽性對照組60.741±0.101*1受試物6倍稀釋組60.578±0.084*1受試物8倍稀釋組60.569±0.085*1受試物10倍稀釋組60.341±0.059*2受試物20倍稀釋組60.119±0.035受試物40倍稀釋組60.104±0.007

3 討論

酵母菌屬真菌類,其致熱成分是全菌體及菌體內(nèi)所含的莢膜多糖和蛋白質(zhì)。研究表明,其所致的發(fā)熱是由注射部位的局部潰爛引發(fā)的劇烈炎癥反應(yīng)導(dǎo)致,動物注射后發(fā)熱反應(yīng)與人類臨床發(fā)熱類似,適合考察清熱藥的解熱作用。巴豆油局部耳刺激作用可使小鼠耳毛細(xì)血管通透性增高,血管內(nèi)液向組織間隙滲出導(dǎo)致耳廓腫脹,適合考察藥物抗炎作用。MDCK細(xì)胞對甲型流感病毒敏感,細(xì)胞被感染后產(chǎn)生細(xì)胞死亡,一般用于研究藥物體外抗流感病毒實驗[12]。

筆者在本實驗中采用對酵母所致發(fā)熱大鼠體溫的影響,對巴豆油致小鼠耳廓腫脹的影響,MDCK細(xì)胞體外抗甲型流感病毒實驗驗證受試物的清熱、抗炎、抗病毒作用。

實驗結(jié)果表明小兒柴桂退熱糖漿可降低酵母所致發(fā)熱大鼠的體溫,明顯減輕巴豆油致小鼠耳廓腫脹度,提高體外甲型流感病毒致細(xì)胞病變的存活率,具有一定的解熱、抗炎及體外抗甲型流感病毒作用。

[1] 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2006:814-815,818-820,830-831.

[2] 彭成.中醫(yī)藥動物實驗方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:975-982.

[3] 唐曉峰,薛漫清,王暉.大鼠發(fā)熱模型及發(fā)熱機制的研究進(jìn)展[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報,2009,25(3):327-331.

[4] 楊鴻,李慧,張文生,等.復(fù)方梔子注射液解熱抗炎作用的研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2005,12(5):25-27.

[5] 初正云,翟延君,張慧.解毒膠囊的解熱、抗炎、止痛和止咳作用[J].中成藥,2008,30(2):181-184.

[6] 潘文,康開彪,王煜.清利通淋湯解熱抗炎作用實驗[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2010,16(15):192-194.

[7] 陳海明,魏金峰,包捷,等.復(fù)方解熱顆粒制劑的藥效及急性毒性研究[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志,2007,6(1): 11-12.

[8] 曲敬來,林娟,高雪,等.痰熱清注射液抗甲型流感病毒的實驗研究[J].中國中醫(yī)藥科技,2012,19(1):28-29.

[9] 朱成杰,趙昆,王桂芳,等.天然多糖在體外抗甲型流感病毒作用的普遍性[J].中國抗生素雜志,2010,35(12): 919-923.

[10] 王黎,夏衛(wèi)軍.童炎康顆粒體外抗病毒作用的研究[J].中醫(yī)臨床研究,2009,(1):12-14.

[11] 趙宏偉,趙玉珍.金蓮花醇提物體外抗甲型流感病毒作用研究[J].藥物研究,2010,19(1):10-11.

[12] 趙宏偉,趙玉珍.黃芪和秦艽提取物抗甲型流感病毒研究[J].鄖陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2010,29(2):138-140.

DOI 10.3870/yydb.2014.07.010

R286;R965

A

1004-0781(2014)07-0878-03

2013-08-12

2013-09-15

王勇(1974-),女,湖北松滋人,主管藥師,學(xué)士,主要從事醫(yī)院藥學(xué)研究。E-mail:wangy74@163.com。

劉曉鋒(1978-),男,湖北荊州人,工程師,碩士,研究方向:藥理學(xué)。E-mail:506219744@qq.com。