李麗,唐燕霞,黃志明,陳潤(rùn)麗,周煥第,劉布鳴,梁鋼

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,南寧 530021;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南寧 530001;3.廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530022)

·藥物研究·

表沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)柔紅霉素致小鼠心臟毒性的預(yù)防作用*

李麗1,2,唐燕霞1,黃志明1,陳潤(rùn)麗1,周煥第2,劉布鳴3,梁鋼1

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,南寧 530021;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南寧 530001;3.廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530022)

目的 觀察表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對(duì)柔紅霉素(DNR)所致小鼠心臟毒性的預(yù)防作用。方法將合格小鼠隨機(jī)分為4組,即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組(DNR致心臟毒性組)、EGCG高劑量組(80 mg·kg-1)、EGCG低劑量組(40 mg·kg-1)。給予EGCG 7 d后,除正常對(duì)照組外,其余各組小鼠腹腔注射DNR(15 mg·kg-1)。48 h后檢測(cè)心電圖、血清心肌酶譜、高敏肌鈣蛋白T(TNT-Hs)、心肌超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果模型對(duì)照組小鼠心律失常發(fā)生率64.7%,丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、α-羥基丁酸脫氫酶(α-HBDH)和TNT-Hs顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01),心肌超微結(jié)構(gòu)明顯損傷;EGCG高劑量組小鼠心律失常發(fā)生率44.4%,EGCG低劑量組小鼠心律失常發(fā)生率31.6%;EGCG各劑量組小鼠血淸心肌酶及TNTHs較模型對(duì)照組顯著降低(P＜0.05或P＜0.01);EGCG低劑量組小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)損傷較模型對(duì)照組明顯減輕。結(jié)論EGCG對(duì)DNR所致小鼠心臟毒性有一定的預(yù)防作用。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯;柔紅霉素;心臟毒性;心肌酶

柔紅霉素(daunorubicin,DNR)屬于蒽環(huán)類藥物。蒽環(huán)類藥物是一類非常有效且常用的抗腫瘤藥物,抗腫瘤譜較廣。在臨床化療方案中,蒽環(huán)類藥物的作用呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系,但隨著劑量的增加,其不良反應(yīng)也愈加突出,尤其是心臟毒性,使其應(yīng)用受到了限制,目前尚無較理想的藥物能夠預(yù)防和治療[1]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯[(-)-epigallocatechin gallate,EGCG]有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗動(dòng)脈硬化、抗炎、抗腫瘤及防治糖尿病腎病的作用[2-3]。研究發(fā)現(xiàn),EGCG可以緩解DNR引起的裸鼠體質(zhì)量減輕,對(duì)DNR引起的裸鼠血液中心肌肌鈣蛋白T(troponin T, cTnT)和膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde, MDA)升高有抑制作用[4]。但EGCG對(duì)DNR所致小鼠心臟毒性有無保護(hù)作用,筆者未見報(bào)道。筆者在本研究中建立DNR致小鼠急性心臟毒性模型,觀察EGCG對(duì)心電圖、心肌酶譜、高敏肌鈣蛋白T(highsensitivity troponin T,TNT-Hs)、心肌超微結(jié)構(gòu)等的影響,探討EGCG對(duì)DNR致心臟毒性的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 昆明種小鼠,清潔級(jí),80只,雌雄各半,體質(zhì)量(20±2)g,購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(桂)2009-0004,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)質(zhì)量合格證號(hào):SCXK桂2009-0002。

1.2 藥物與試劑 DNR(Actavis Italy S.p.A.,批號(hào): 1F10111)。EGCG(含量:97%,HPLC法,杭州禾田生物技術(shù)有限公司,批號(hào):20100125,臨用前用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液制成混懸液)。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase,ALT,批號(hào):20130403)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase,AST,批號(hào): 20130401)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH,批號(hào):20130405)試劑盒為上海執(zhí)誠(chéng)生物科技股份有限公司產(chǎn)品;肌酸激酶(creatine kinase,CK,批號(hào): 20130205)、肌酸激酶MB同工酶(creatine kinase MB isoenzyme,CK-MB,批號(hào):20130210)、α-羥基丁酸脫氫酶(alpha hydroxybutyrate dehydrogenase,α-HBDH,批號(hào):20130201)試劑盒為德賽診斷系統(tǒng)(上海)有限公司產(chǎn)品。TNT-Hs檢測(cè)試劑盒(批號(hào):20130418)為羅氏公司產(chǎn)品。

1.3 儀器 BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);7600-020AutomaticAnalyzer (HITACHI);羅氏Cobas 6000;H-7650型透射電鏡(日本日立)。

1.4 模型的制備及給藥 健康小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,檢測(cè)心電圖,取正常者采用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行完全隨機(jī)化分組,共分為4組,即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、EGCG高劑量組(80 mg·kg-1)、EGCG低劑量組(40 mg·kg-1)。每組20只,雌雄各半。EGCG各劑量組分別灌胃給藥(20 mL·kg-1),正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃給予等體積溶劑,即0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。每天1次,共7 d。在末次灌胃給藥1 h后,除正常對(duì)照組腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液外,其余各組小鼠腹腔注射DNR(15 mg·kg-1),復(fù)制DNR急性心臟毒性模型[5]。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 癥狀和體征 觀察小鼠一般生長(zhǎng)狀況、外觀、飲食等。

1.5.2 心電圖 注射DNR 48 h后,小鼠用3%水合氯醛腹腔注射麻醉,仰臥固定,采用標(biāo)準(zhǔn)肢體II導(dǎo)聯(lián)描記心電圖,觀察心律失常的發(fā)生率。本實(shí)驗(yàn)中,出現(xiàn)各種類型的期前收縮、房室傳導(dǎo)阻滯、竇性心動(dòng)過速、竇性心動(dòng)過緩等之一者為心律失常陽(yáng)性[6]。

1.5.3 TNT-Hs測(cè)定 采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清TNT-Hs含量。

1.5.4 血清ALT、AST和心肌酶譜 記錄心電圖后,小鼠摘眼球取血,分離血清,在全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定ALT、AST和心肌酶譜(CK、CK-MB、LDH、α-HBDH)活性。

1.5.5 電鏡觀察 小鼠采血后,迅速開胸取心臟,用預(yù)冷0.9%氯化鈉溶液沖洗,濾紙吸干后稱質(zhì)量。取心尖部米粒大小心肌,2.5%戊二醛和1%鋨酸雙重固定,丙酮脫水,樹脂包埋,超薄切片,1%醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛雙重染色,透射電鏡觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0版統(tǒng)計(jì)軟件,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩組樣本率比較采用Fisher's確切概率法,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGCG對(duì)DNR致心臟毒性小鼠一般狀況的影響 正常對(duì)照組小鼠活動(dòng)、攝食、糞便、皮毛等生長(zhǎng)狀況良好;腹腔注射DNR后1 d,模型對(duì)照組小鼠出現(xiàn)活動(dòng)遲緩、攝食減少、豎毛等;除正常對(duì)照組外,其余各組小鼠陸續(xù)出現(xiàn)死亡,最后剩余小鼠數(shù)為:模型對(duì)照組17只,EGCG高劑量組18只,EGCG低劑量組19只。但EGCG給藥組小鼠一般狀況好于模型對(duì)照組。

2.2 EGCG對(duì)DNR致心臟毒性小鼠心電圖的影響 注射DNR 48 h后,模型對(duì)照組小鼠心律失常發(fā)生率顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01);EGCG低劑量組與模型對(duì)照組比較,心律失常發(fā)生率有所降低(P＜0.05)。結(jié)果見表1。

2.3 EGCG對(duì)DNR致心臟毒性小鼠血清TNT-Hs的影響 模型對(duì)照組血清TNT-Hs顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01)。與模型對(duì)照組比較,EGCG高、低劑量組血清TNT-Hs顯著降低(P＜0.01),見表2。

表1 4組小鼠心電圖測(cè)定結(jié)果Tab.1 Determination results of electrocardiogramin four groups of mice

表2 4組小鼠TNT-Hs測(cè)定結(jié)果Tab.2 Determination results of TNT-Hs in four groups of mice ±s

表2 4組小鼠TNT-Hs測(cè)定結(jié)果Tab.2 Determination results of TNT-Hs in four groups of mice ±s

與正常對(duì)照組比較,*1P＜0.01;與模型對(duì)照組比較,*2P＜0.01Compared with normal control group,*1P＜0.01;Compared with model control group,*2P＜0.01

組別小鼠/只劑量/ (mg·kg-1) TNT-Hs/ (ng·mL-1)正常對(duì)照組20…0.04±0.01模型對(duì)照組17…0.23±0.06*1EGCG高劑量組18800.06±0.01*2低劑量組19400.06±0.02*2

2.4 EGCG對(duì)DNR致心臟毒性小鼠血清ALT、AST和心肌酶譜的影響 模型對(duì)照組血清ALT、AST和心肌酶譜(CK、CK-MB、LDH、α-HBDH)活性均顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01)。EGCG高、低劑量組血清ALT、AST和心肌酶活性較模型對(duì)照組明顯降低(P＜0.05或P＜0.01),見表3。

表3 4組小鼠血清ALT、AST和心肌酶譜測(cè)定結(jié)果Tab.3 Determination results of ALT,AST and myocardial enzymes in four groups of mice U·L-1,±s

表3 4組小鼠血清ALT、AST和心肌酶譜測(cè)定結(jié)果Tab.3 Determination results of ALT,AST and myocardial enzymes in four groups of mice U·L-1,±s

與正常對(duì)照組比較,*1P＜0.01;與模型對(duì)照組比較,*2P＜0.01,*3P＜0.05Compared with normal control group,*1P＜0.01;Compared with model control group,*2P＜0.01,*3P＜0.05

組別小鼠/只劑量/ (mg·kg-1)ALTASTCKLDHCK-MBα-HBDH正常對(duì)照組20…57.6±15.4135.7±30.6597.9±357.4712.7±246.5401.2±97.9256.1±102.3模型對(duì)照組17…105.9±49.8*1349.3±115.3*12 272.4±606.5*11 349.2±301.0*11 039.79±249.4*1551.8±179.3*1EGCG高劑量組188060.8±14.1*2232.6±33.3*21 711.3±657.3*3955.4±276.6*2889.7±145.7*3370.1±118.1*2低劑量組194062.6±40.1*2254.2±58.0*21 422.2±504.8*2747.0±119.9*2807.9±136.2*2282.2±55.6*2

2.5 EGCG對(duì)DNR致心臟毒性小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響 正常對(duì)照組心肌細(xì)胞排列有序,肌纖維肌小節(jié)結(jié)構(gòu)清晰,線粒體含量豐富,包膜完整,線粒體嵴密度適中(圖1A)。與正常對(duì)照組相比,模型對(duì)照組心肌細(xì)胞腫脹,部分肌絲斷裂,排列紊亂,線粒體腫脹,線粒體嵴出現(xiàn)斷裂(圖1B)。EGCG低劑量組心肌細(xì)胞心肌纖維結(jié)構(gòu)基本正常,少數(shù)線粒體嵴斷裂,個(gè)別肌絲溶解,線粒體腫脹較輕,心肌損傷明顯輕于模型對(duì)照組(圖1C)。

3 討論

人應(yīng)用DNR治療時(shí),當(dāng)DNR的累積劑量超過300 mg·(m2)-1,易出現(xiàn)嚴(yán)重的心臟毒性,其早期急性心臟毒性的特征性之一表現(xiàn)為心律失常[7-8],因此心電圖是監(jiān)測(cè)DNR心臟毒性的重要指標(biāo)之一。研究表明,在人類肝臟中廣泛存在的羰基還原酶1能將DNR轉(zhuǎn)化成一種新的醇代謝物柔紅霉素醇。這種新生成的醇代謝物不僅抗腫瘤活性比DNR低,還會(huì)對(duì)心臟產(chǎn)生毒性,造成心肌細(xì)胞損傷[9]。心肌細(xì)胞膜受損,細(xì)胞內(nèi)的多種酶外漏,如LDH、CK等,嚴(yán)重影響細(xì)胞功能[10]。因此,血清ALT、AST和心肌酶譜(CK、CK-MB、LDH、α-HBDH)是臨床反映心肌損害的主要生化指標(biāo),其可信度高,重復(fù)性好。TNT-Hs為心肌結(jié)構(gòu)蛋白,在心肌細(xì)胞膜完整時(shí),不能透過細(xì)胞膜進(jìn)入血循環(huán),因此正常人血清中含量極微。而當(dāng)心肌細(xì)胞因缺血缺氧受到損傷時(shí),由于細(xì)胞膜的通透性增高,TNT-Hs通過細(xì)胞膜進(jìn)入外周血。TNT-Hs是心肌細(xì)胞損傷的高敏感性標(biāo)志物,可檢出某些心肌酶譜不能檢出的微小心肌損傷,逐漸成為診斷心肌損傷首選的血清標(biāo)志物[11]。本實(shí)驗(yàn)表明,單次腹腔注射DNR 15 mg·kg-1可誘發(fā)小鼠心律失常,ALT、AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBDH水平升高,TNT-Hs釋放增多,心肌超微結(jié)構(gòu)明顯損傷,DNR致小鼠心臟毒性模型復(fù)制成功。

A.正常對(duì)照組(×15 000);B.模型對(duì)照組(×15 000);C.EGCG低劑量組(×20 000)圖1 EGCG對(duì)DNR致心毒性小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響A.Normal control group(×15 000);B.model control group(×15 000);C.EGCG 40 mg·kg-1group(×20 000)Fig.1 Effect of EGCG on myocardial ultrastructure of mice with DNR-induced cardiotoxicity

EGCG藥理作用廣泛,不僅具有抗氧化、抗紫外線輻射、抗菌等作用,還具有抗癌、抗突變、預(yù)防和治療心腦血管系統(tǒng)疾病以及調(diào)理內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)等生物活性[12]。EGCG能增強(qiáng)阿糖胞苷對(duì)人白血病HL-60細(xì)胞的抗腫瘤活性[13]。在裸鼠肝癌移植瘤實(shí)驗(yàn)中,EGCG可有效抑制羰基還原酶的代謝活性,增強(qiáng)DNR抗腫瘤作用并降低其心臟毒性[4]。本研究結(jié)果顯示,預(yù)先給予EGCG,可以改善DNR所致心臟毒性小鼠的一般生長(zhǎng)狀況,降低心律失常發(fā)生率,抑制血清心肌酶增高,降低血清TNT-Hs含量,減輕心肌超微結(jié)構(gòu)損傷,從而預(yù)防DNR的心臟毒性,其可能機(jī)制是通過抑制羰基還原酶,減少DNR代謝為柔紅霉素醇。由此筆者設(shè)想EGCG與DNR聯(lián)用,可能既預(yù)防或減輕DNR對(duì)心肌的損傷,又協(xié)同或增強(qiáng)DNR的抗腫瘤作用。這一研究結(jié)果或可為腫瘤的藥物防治提供新的思路,也將為EGCG的進(jìn)一步研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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DOI 10.3870/yydb.2014.07.001

Protective Effects of(-)-Epigallocatechin Gallate on Daunorubicin-induced Cardiotoxicity in Mice

LI Li1,2,TANG Yan-xia1,HUANG Zhi-ming1,CHEN Run-li1,ZHOU Huan-di2,LIU Bu-ming3,LIANG Gang1
(1.Pharmaceutical College,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China;2.Pharmaceutical College, Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530001,China;3.Guangxi Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Standards,Nanning 530022,China)

ObjectiveTo investigate the protective effects of(-)-epigallocatechin gallate(EGCG)on daunorubicin (DNR)-induced cardiotoxicity in mice.MethodsThe qualified mice were randomly divided into four groups:normal control group,myocardial injured model control group,high dose group(80 mg·kg-1)and lowdose group(40 mg·kg-1)of EGCG. EGCG was administered intragastrically once daily for 7 days,followed by a single intraperitoneal injection of DNR(15 mg·kg-1) except in the normal control group.The electrocardiogram,myocardial enzymes and TNT-Hs in serum,cardiac ultrastructure of mice were detected after 48 h.ResultsIn DNR model control group,the incidence of arrhythmia was 64.7%.The activity of serumcardic enzymes including CK,CK-MB,LDH,α-HBDH and ALT,AST,level of TNT-Hs were significantly higher than those in the normal control group(P＜0.01),and myocardial ultrastructure was injured remarkably.The incidence of arrhythmia was 44.4%in mice treated with high dose of EGCG and 31.6%in mice with lowdose of EGCG.Compared to the model control group,the activity of CK,CK-MB,LDH,α-HBDH and ALT,AST,level of TNT-Hs in serumdecreased remarkably in EGCG groups(P＜0.05 or P＜0.01).Lowcan EGCG alleviated the injury to the ultrastructure of myocardiumcompared to the model control group.ConclusionEGCG can prevent the cardiac toxicity induced by DNR in mice.

(-)-Epigallocatechin gallate;Daunorubicin;Cardiotoxicity;Myocardial enzymes

R286;R965

A

1004-0781(2014)07-0841-04

2013-08-28

2013-09-22

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160532);教育部博士點(diǎn)基金博導(dǎo)類課題(20134503110007);廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012GXNSFAA053147);廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院)開放課題基金項(xiàng)目(桂中重開201105)

李麗(1973-),女,廣西東蘭人,副教授,碩士生導(dǎo)師,博士,主要從事中草藥藥效及抗腫瘤分子藥理學(xué)研究。電話:0771-2279423,E-mail:lilygxnn@163.com。

梁鋼(1957-),男,廣東順德人,教授,博士生導(dǎo)師,博士,主要從事抗腫瘤分子藥理學(xué)及其新藥的研究。電話: 0771-5302271,E-mail:lianggang22@aliyun.com。