盛健，吳峰，夏甘霖，羅力，劉光華，潘華鋒，吳遠(yuǎn)志，王旭

(武鋼第二職工醫(yī)院外科，武漢 430085)

雷公藤甲素對胰腺癌干細(xì)胞的影響

盛健，吳峰，夏甘霖，羅力，劉光華，潘華鋒，吳遠(yuǎn)志，王旭

(武鋼第二職工醫(yī)院外科，武漢 430085)

目的 探討雷公藤甲素(TPL)對胰腺癌干細(xì)胞的影響。方法利用不同濃度TPL處理人胰腺癌細(xì)胞PANC-1,流式細(xì)胞術(shù)檢測胰腺癌干細(xì)胞相關(guān)分子CD44、CD24、ESA、CD133及ALDH1表達(dá),流式分選表型的PANC-1細(xì)胞作為干細(xì)胞,再分別通過體外細(xì)胞球體形成實(shí)驗(yàn)及NOD/SCID小鼠體內(nèi)移植瘤成瘤實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證TPL對胰腺癌干細(xì)胞成球及成瘤能力的影響。結(jié)果10,25 nmol·L-1TPL可抑制PANC-1細(xì)胞表面CD44、CD24、CD133及ALDH1表達(dá),并可以抑制胰腺癌干細(xì)胞成球能力[對照組成球(30±4)個(gè),5 nmol·L-1TPL組(13±2)個(gè),10 nmol·L-1TPL組(5±1)個(gè),P＜0.01]及成瘤能力(抑瘤率76.5%)。結(jié)論TPL能夠抑制胰腺癌干細(xì)胞功能,可能是其抑制胰腺癌的機(jī)制之一。

雷公藤甲素；癌,胰腺；干細(xì)胞

胰腺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤,目前發(fā)病率呈上升趨勢。因胰腺癌早期診斷困難,手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高而效果較差,也缺乏有效的化學(xué)治療(化療)藥物,且對放射治療(放療)不敏感,在消化系統(tǒng)腫瘤中預(yù)后最差,總體五年生存率不足5%[1]。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell,CSC)是一類具有自我更新與增殖分化潛能的細(xì)胞,在特定條件下可以形成不同分化程度的腫瘤細(xì)胞,被認(rèn)為在腫瘤發(fā)生發(fā)展、耐藥、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要作用[2-3]。胰腺癌干細(xì)胞近年來成為研究的熱點(diǎn),目前研究表明,表型的胰腺癌細(xì)胞可能具有干細(xì)胞特性,而CD133、乙醛脫氫酶1 (Aldehyde dehydrogenase 1,ALDH1)等也可作為富集胰腺癌干細(xì)胞的標(biāo)志[3-5]。雷公藤甲素(triptolide, TPL)是從衛(wèi)矛科植物雷公藤中提取出的一種活性物質(zhì),是雷公藤的主要有效成分,在體內(nèi)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。近年來研究發(fā)現(xiàn),TPL具有明顯的抑制胰腺癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的作用,也可顯著增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對放療和化療的敏感性[6-8]。但TPL是否可以影響胰腺癌干細(xì)胞的數(shù)量及功能,目前尚不清楚。筆者在本實(shí)驗(yàn)中擬通過TPL干預(yù)人胰腺癌細(xì)胞PANC-1,探討TPL對胰腺癌干細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人胰腺癌細(xì)胞PANC-1由本醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室傳代所得,培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37℃、5%二氧化碳溫箱內(nèi)。

1.2 主要試劑 抗CD44、CD24、ESA及ALDH1抗體均購自美國BD公司(貨號依次為559942,555428, 347197,611195),CD133購自德國美天旎公司(貨號: 130-080-801)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物非肥胖性糖尿病聯(lián)合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency,NOD/SCID)小鼠,雌性,8周齡,體質(zhì)量20～24 g,購自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號: SCXK(鄂)2008-0004,置于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級動(dòng)物中心飼養(yǎng)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測 將對數(shù)生長期的PANC-1細(xì)胞接種于6孔板,細(xì)胞融合度達(dá)到50%～60%時(shí)改用無血清培養(yǎng)基孵育24 h后,按梯度每孔加入不同濃度(10或25 nmol·L-1)TPL,對照組加入等量二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)。24 h后收集細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)洗滌兩次,分別標(biāo)記CD44、CD24、ESA、CD133及ALDH1,利用FACSCalibur檢測并分析。

1.4 體外細(xì)胞球體形成實(shí)驗(yàn) 利用CD44、CD24、ESA 3種抗體流式分選表型的PANC-1細(xì)胞作為干細(xì)胞,以每孔1 000個(gè)的密度接種于含有干細(xì)胞培養(yǎng)液[含10 ng·mL-1成纖維細(xì)胞生長因子、20 ng·mL-1表皮生長因子、5 μg·mL-1胰島素、2.75 mg·mL-1轉(zhuǎn)鐵蛋白及2.75 μg·mL-1硒(ITS)]的超低吸附24孔板(康寧)中,每孔給予不同濃度TPL,培養(yǎng)14 d,普通光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆形成個(gè)數(shù)。

1.5 NOD/SCID小鼠體內(nèi)移植瘤成瘤實(shí)驗(yàn) 將上述分選所得干細(xì)胞計(jì)數(shù),以每只5×103個(gè)接種于NOD/SCID小鼠右腹部皮下,15 d后均出現(xiàn)肉眼可見的皮下移植瘤,利用游標(biāo)卡尺測定瘤體大小,計(jì)算體積,挑選12只瘤體體積和體質(zhì)量接近的小鼠,隨機(jī)分為兩組,每組6只,實(shí)驗(yàn)組給予0.25 mg·kg-1·d-1TPL,皮下腫瘤周圍注射給藥,連續(xù)給藥15 d;對照組給予含等量DMSO的0.9%氯化鈉溶液。每隔3 d測量移植瘤體積1次并記錄。第15天停藥,第16天處死裸鼠,仔細(xì)剝離瘤塊并稱質(zhì)量,按下列公式計(jì)算抑瘤率。抑瘤率(%)=(對照組平均瘤質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量)/對照組平均瘤質(zhì)量×100%。

2 結(jié)果

2.1 TPL可降低PANC-1細(xì)胞中胰腺癌干細(xì)胞標(biāo)志的表達(dá) PANC-1細(xì)胞在TPL(10或25 nmol·L-1)或等量DMSO作用24 h后,分別標(biāo)記CD44、CD24、ESA、 CD133及ALDH1抗體,流式細(xì)胞術(shù)檢測及ALDH1的表達(dá),結(jié)果見表1。TPL可降低PANC-1細(xì)胞中及ALDH1+表達(dá),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。但TPL對ESA的表達(dá)沒有顯著性影響。

3 討論

腫瘤干細(xì)胞理論于1997年提出,BONNET等[2]從人急性髓性細(xì)胞白血病患者中發(fā)現(xiàn)并成功分離出腫瘤干細(xì)胞。相對于血液系統(tǒng)腫瘤,實(shí)體瘤中的干細(xì)胞較難分離及研究。2003年,AL-HAJJ等首次從人類乳腺腫瘤中分離出一群細(xì)胞,并通過將該種細(xì)胞接種至NOD/SCID小鼠身上,發(fā)現(xiàn)100個(gè)細(xì)胞就可以100%成瘤,從而為實(shí)體瘤干細(xì)胞研究打開了局面[9]。LI等[4]于2007年在胰腺癌中篩選出細(xì)胞,并發(fā)現(xiàn)這群細(xì)胞具有自我更新、多向分化潛能及極強(qiáng)的成瘤能力,從而把CD44、CD24及ESA 3個(gè)指標(biāo)作為分選富集胰腺癌干細(xì)胞的重要標(biāo)志。隨著研究的深入,其他一些細(xì)胞表面蛋白如CD133、ALDH1等也被認(rèn)為與胰腺癌干細(xì)胞相關(guān),并且發(fā)現(xiàn)利用不同表面分子分選的干細(xì)胞群之間有一定的交集,從而為人們理解干細(xì)胞的定義和功能提供了新的方向[3,5]。

表1 TPL可降低PANC-1細(xì)胞中胰腺癌干細(xì)胞標(biāo)志表達(dá)情況Tab.1 Expression decline of pancreatic cancer stem cell markers in PANC-1 cells at the presence of TPL %

目前人們認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,尤其在惡性腫瘤化療耐藥復(fù)發(fā)等進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[3,10]。TPL作為祖國傳統(tǒng)中藥雷公藤的主要活性成分,研究表明對多種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用,能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[11]。既往研究也發(fā)現(xiàn)TPL對胰腺癌細(xì)胞具有阻斷細(xì)胞周期、抗細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用,TPL同時(shí)還可以增加胰腺癌對放療或化療的敏感性[8,12],但TPL抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的具體機(jī)制尚不清楚。

筆者在本實(shí)驗(yàn)中通過流式細(xì)胞學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),TPL可以降低PANC-1細(xì)胞中某些與胰腺癌干細(xì)胞相關(guān)的表達(dá),提示TPL可能通過干預(yù)胰腺癌干細(xì)胞從而發(fā)揮抑制胰腺癌的作用。進(jìn)而,筆者利用作為標(biāo)志流式分選富集PANC-1中的胰腺癌干細(xì)胞,并通過體外細(xì)胞球體形成實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)移植瘤成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了TPL對于胰腺癌干細(xì)胞的成球及成瘤能力具有明顯的抑制作用,從而為TPL應(yīng)用于臨床胰腺癌的治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。而且筆者發(fā)現(xiàn)TPL對于PANC-1細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號通路有一定的影響(結(jié)果未列出),而既往研究表明Wnt/β-catenin在維持干細(xì)胞干性的過程中發(fā)揮重要作用[13]。TPL是否通過Wnt/β-catenin調(diào)節(jié)胰腺癌干細(xì)胞的功能,有待進(jìn)一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.011

Effect of Triptolide on Pancreatic Cancer Stem Cells

SHENG Jian,WU Feng,XIA Gan-lin,LUO Li,LIU Guang-hua,PAN Hua-feng,WU Yuan-zhi,WANG Xu
(Department of Surgery,the Second Worker Hospital of Wuhan Iron and Steel Company,Wuhan 430085,China)

Objective To investigate the effect of triptolide on pancreatic cancer stem cells.MethodsHuman pancreatic cancer cells PANC-1 were treated with different doses of triptolide.Pancreatic cancer stem cell markers including CD44, CD24,ESA,CD133 and ALDH1 were measured by flow cytometry.ESA+PANC-1cells were sorted as pancreatic cancer stem cells.Cell spheres formationin vitroand xenografts tansplantation in NOD/SCID mice were tested to detect the effect of triptolide on pancreatic cancer stem cells.ResultsTriptolide reduced the expression of CD44,CD24,CD133 and ALDH1 in PANC-1,significantly inhibitted the ability of spheres formation(counts of spheres:30±4 in the control,13±2 in TPL at 5 nmol ·L-1and(5±1)in TPL at 10 nmol·L-1,P＜0.01),and reduced xenografts formation by 76.5%.ConclusionTriptolide could restrain the function of pancreatic cancer stem cells,which may account for the inhibition effect of triptolide on pancreatic carcinoma.

Triptolide;Pancreatic carcinoma;Cancer stem cell

R735.9;R965

A

1004-0781(2014)03-0315-03

2013-06-01

2013-07-12

盛健(1977-),男,湖北武漢人,主治醫(yī)師,研究方向:胃腸道腫瘤。E-mail：66353327@qq.com。

王旭(1965-),男,河北石家莊人,主任醫(yī)師,碩士,研究方向:胃腸道腫瘤。E-mail：zhaohmwx@163.com。