莫單丹，唐炳蘭，周小雷，王碩，劉振杰，谷筱玉，袁經(jīng)權(quán)

(廣西藥用植物研究所天然藥物化學(xué)組分研究室，南寧 530023)

小鉆提取物抗炎鎮(zhèn)痛活性研究*

莫單丹，唐炳蘭，周小雷，王碩，劉振杰，谷筱玉，袁經(jīng)權(quán)

(廣西藥用植物研究所天然藥物化學(xué)組分研究室，南寧 530023)

目的 篩選小鉆抗炎鎮(zhèn)痛活性部位,為小鉆的開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法萃取法制備不同極性小鉆提取物(石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物)。將小鼠分為正常組、陽(yáng)性對(duì)照阿司匹林組(50 mg·kg-1)或洛芬待因組(含可待因6.76 mg·kg-1)和小鉆石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水提取物組(500 mg·kg-1),均灌胃給藥7 d。通過(guò)二甲苯致小鼠耳腫脹、小鼠棉球肉芽腫的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及各萃取物調(diào)節(jié)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞分泌一氧化氮(NO)水平的體外實(shí)驗(yàn)篩選抗炎活性部位,通過(guò)小鼠熱板法、醋酸扭體法篩選鎮(zhèn)痛活性部位。結(jié)果小鉆乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物均能顯著抑制二甲苯所致的小鼠急性耳廓腫和小鼠棉球肉芽腫(P＜0.05,P＜0.01),且均能顯著降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO釋放(P＜0.01),具備一定抗炎活性;小鉆乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物均能顯著減少冰醋酸所致小鼠扭體次數(shù),提高熱板致痛鼠的痛閾(P＜0.05,P＜0.01),具有一定的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)論小鉆乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物均具有抗炎鎮(zhèn)痛活性。

小鉆提取物；抗炎；鎮(zhèn)痛

小鉆(瑤語(yǔ):fiuv nzunx)為瑤藥經(jīng)典“老班藥”中“十八鉆”之一,別名小怎美(fiuv zing hmei)、銅精端、小鉆骨風(fēng)、南五味子、紅木香、紫金皮、內(nèi)風(fēng)消、大活血,來(lái)源于五味子科南五味子屬植物長(zhǎng)梗南五味子Kasdsura longipedunculataFinet et Gagnep的根和莖。主要分布于我國(guó)南部,如云南、四川、浙江、福建、廣東、廣西等省。小鉆味甘、苦、辛,性溫,屬風(fēng)打相兼藥。能健脾補(bǔ)腎,理氣活血,祛風(fēng)通絡(luò),消腫止痛。小鉆為廣西瑤醫(yī)習(xí)用藥材,用于治療產(chǎn)后水腫、經(jīng)閉腹痛、疝氣痛、腎虛腰痛、胃痛、頭風(fēng)痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷和骨折等[1]。目前未見(jiàn)關(guān)于小鉆抗炎鎮(zhèn)痛活性方面的報(bào)道。筆者在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)小鉆的抗炎鎮(zhèn)痛活性進(jìn)行研究,以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用小鉆提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試藥 小鉆藥材采自廣西壯族自治區(qū)金秀瑤族自治縣,經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)劉壽養(yǎng)教授鑒定為五味子科南五味子屬植物長(zhǎng)梗南五味子(Kasdsura longipedunculataFinet et Gagnep)。取其干燥根和莖打成粗粉,用80%乙醇浸泡提取2次,每次7 d?；厥找掖?提取浸膏溶于適量水,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,并減壓濃縮得石油醚提取物(A)、乙酸乙酯提取物(B)、正丁醇提取物(C)和水提取物(D)。各組分均用0.5%羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose,CMC)溶液超聲溶解,分別配成50 mg·mL-1溶液,備用;阿司匹林腸溶片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司,批號(hào):BJ07490,使用時(shí)以純化水配成5 mg·mL-1);洛芬待因緩釋片(西南藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):121105);二甲苯(分析純,上海試劑一廠,批號(hào):試-2005-06-12);冰醋酸(分析純,成都市科龍化工試劑廠,批號(hào):20100111);改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's Medium,DMEM)高糖培養(yǎng)基(北京Hyclone);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);一氧化氮試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);脂多糖(lipopolysaccharides,LPS),美國(guó)Sigma公司);四甲基偶氮唑藍(lán)(mmethyl thiazolyl tetrazolium,MTT,美國(guó)Sigma公司)。

1.2 動(dòng)物 昆明種小鼠(SPF級(jí)),體質(zhì)量(20±2)g,由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(桂)2012-0003。

1.3 細(xì)胞 RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))。

1.4 儀器 EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司),HX-T電子天平(慈溪市天東衡器廠),電子分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司),YLSQ4耳沖打孔器(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司), YLS-6B智能熱板儀(北京安得爾科技有限公司), DMI4000B倒置顯微鏡(德國(guó)Leica),BC-J80S50CO2培養(yǎng)箱(上海博訊),YXQ-LS-100SII高壓滅菌器(上海博訊),Infinite?F200 pro多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan)。

1.5 抗炎作用實(shí)驗(yàn)

1.5.1 小鼠急性耳廓腫 取小鼠60只,雌雄各半,隨機(jī)分為6組,每組10只。即正常組(純化水),陽(yáng)性對(duì)照組(阿司匹林50 mg·kg-1),小鉆石油醚組(A),小鉆乙酸乙酯組(B),小鉆正丁醇組(C),小鉆水提物組(D) (均含生藥量500 mg·kg-1),灌胃給藥,qd,連續(xù)給藥7 d,末次給藥后1 h,二甲苯0.1 mL均勻涂布于各鼠右耳正反面,左耳不處理,30 min后將小鼠處死,用8 mm打孔器在兩耳同一部位扎下左右耳片,精密稱質(zhì)量,以右耳質(zhì)量減去左耳質(zhì)量,作為耳廓炎性腫脹度,計(jì)算右耳腫脹度及抑制率[2]。抑制率(%)=(空白組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/空白組平均腫脹度×100%。

1.5.2 棉球肉芽腫 取雄性小鼠60只,乙醚淺麻醉下腹部切口,將一個(gè)已高壓滅菌的棉球10 mg植入小鼠右側(cè)腋窩皮下。分組及給藥方法同“1.5.1”,連續(xù)7 d,末次給藥后1 h處死小鼠,剝離肉芽腫棉球,剔除脂肪組織,在70℃烘箱中干燥2 h后稱質(zhì)量,減去原棉球質(zhì)量即為肉芽腫質(zhì)量[3],并計(jì)算抑制率。抑制率(%)=(空白組平均肉芽腫質(zhì)量-給藥組平均肉芽腫質(zhì)量)/空白組平均肉芽腫質(zhì)量×100%。

1.5.3 細(xì)胞的培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞在37℃、5%二氧化碳(CO2)條件下,用含10%胎牛血清、青霉素(100 U·mL-1)及鏈霉素(50 μg·mL-1)的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期。

1.5.4 小鉆提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞,胰酶消化,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為105個(gè)·mL-1,接種于96孔培養(yǎng)板中(每孔100 μL),培養(yǎng)24 h后,給藥,空白組加10%血清DMEM培養(yǎng)液,繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,取出培養(yǎng)板,各孔加入5 mg·mL-1MTT20 μL,放入培養(yǎng)箱中孵育4 h,棄去上清液,每孔加二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)150 μL,把96孔培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀中震蕩10 min,波長(zhǎng)492 nm處測(cè)量各孔吸光度(A)值,計(jì)算細(xì)胞相對(duì)抑制率[4]。細(xì)胞相對(duì)抑制率(%)= (1-實(shí)驗(yàn)組A均值/對(duì)照組A均值)×100%。

1.5.5 小鉆提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞LPS刺激模型NO釋放的影響 將細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用0.25%胰蛋白酶消化105個(gè)·mL-1,接種于96孔培養(yǎng)板(每孔100 μL),培養(yǎng)24 h后,加入含小鉆萃取物的DMEM培養(yǎng)基(終濃度分別為50,100,200 μg·mL-1,每個(gè)劑量組復(fù)孔為8個(gè)),并加入LPS(終濃度1 μg·mL-1),同時(shí)設(shè)定空白組(加培養(yǎng)基)、模型組(加培養(yǎng)基和LPS)繼續(xù)孵育24 h,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定NO。

1.6 鎮(zhèn)痛作用

1.6.1 醋酸扭體法 取小鼠60只,雌雄各半,分組及給藥方法同“1.5”項(xiàng),連續(xù)7 d,末次給藥后1 h腹腔注射0.7%醋酸溶液,每只0.4 mL。觀察并記錄注射醋酸溶液15 min內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)的次數(shù),計(jì)算藥物鎮(zhèn)痛百分率[5]。鎮(zhèn)痛百分率(%)=(空白組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù))/空白組扭體次數(shù)×100%。

1.6.2 熱板法 選出對(duì)55℃熱板痛覺(jué)反應(yīng)在10～30 s的雄性小鼠60只,隨機(jī)分為6組,每組10只。陽(yáng)性組給予洛芬待因緩釋片(含磷酸可待因6.76 mg·kg-1),空白對(duì)照組給予同體積純化水,灌胃給藥,連續(xù)7 d,按0.5 g·kg-1劑量給藥,每只小鼠給藥前及末次給藥后30,60,90,120 min測(cè)定痛反應(yīng)潛伏期,計(jì)算痛閾提高率[4]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。各組間比較采用t檢驗(yàn),P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)小鼠耳廓腫脹的影響 從表1可知,B、C、D組二甲苯所致小鼠急性耳廓腫脹均被顯著抑制,其中C組抑制率55.83%,與純化水組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),B組和D組與純化水組比較,均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 6組小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of auricle swelling test in six groups of mice ±s

表1 6組小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of auricle swelling test in six groups of mice ±s

與純化水組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with purified water group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

組別小鼠/只劑量/(mg·kg-1)耳廓腫脹度/mg耳腫脹抑制率/%純化水組1009.08±4.020.00阿司匹林組10503.40±0.98*162.55 A組105008.57±1.665.61 B組105005.41±1.21*240.41 C組105004.01±1.20*155.83 D組105005.45±1.43*239.97

2.2 對(duì)小鼠棉球肉芽腫的影響 見(jiàn)表2。B、C、D組小鼠棉球肉芽腫均被抑制,與純化水組比較,均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 6組小鼠棉球肉芽腫實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of granuloma test induced by cotton ball in six groups of mice ±s

表2 6組小鼠棉球肉芽腫實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of granuloma test induced by cotton ball in six groups of mice ±s

與純化水組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with purified water group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

組別小鼠/只劑量/(mg·kg-1)肉芽腫干重/mg抑制率/%純化水組10028.48±3.430.00阿司匹林組105021.21±3.14*125.53 A組1050025.74±3.189.58 B組1050022.44±3.88*221.21 C組1050024.12±3.44*215.31 D組1050023.02±3.83*219.17

2.3 小鉆提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞LPS刺激模型NO釋放的影響 見(jiàn)表3。石油醚提取物對(duì)細(xì)胞有很大毒性,故未繼續(xù)進(jìn)行“1.5.5”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。從表3可知,乙酸乙酯、正丁醇、水提取物均能顯著降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO釋放,顯示出一定的抗炎活性。

2.4 對(duì)小鼠醋酸性扭體反應(yīng)的抑制作用 見(jiàn)表4,B、C、D組提取物均有鎮(zhèn)痛作用,能減少冰醋酸所致的小鼠扭體次數(shù),其中C組15 min內(nèi)扭體次數(shù)與純化水組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),B組和D組15 min內(nèi)扭體次數(shù)與純化水組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表3 5組RAW264.7細(xì)胞NO濃度測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results of NO concentration in five group of RAW264.7 cells n=8,±s

表3 5組RAW264.7細(xì)胞NO濃度測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results of NO concentration in five group of RAW264.7 cells n=8,±s

與模型組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with model group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

組別劑量/(μg·mL-1) NO濃度/(μmol·L-1)空白組07.82±0.30*1模型組09.36±0.29 B組2006.23±0.49*11006.17±0.80*1505.60±0.79*1C組2007.20±0.61*11006.94±0.66*1506.61±0.54*1D組2006.82±0.64*11007.01±0.88*1508.99±0.81

表4 6組小鼠扭體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of writhing test in six groups of mice ±s

表4 6組小鼠扭體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of writhing test in six groups of mice ±s

與純化水組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with purified water group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

組別小鼠/只劑量/(mg·kg-1) 15 min內(nèi)扭體次數(shù)/次鎮(zhèn)痛率/%純化水組10033.3±5.30.00阿司匹林組105014.6±4.356.16 A組1050032.7±6.41.80 B組1050020.3±7.3*139.04 C組1050022.9±9.2*231.23 D組1050017.6±6.2*147.15

2.5 小鼠熱板法鎮(zhèn)痛作用 由表5可見(jiàn),B組和C組熱板致痛鼠的痛閾值與給藥前相比,均顯著提高,B組小鼠給藥后90和120 min及C組小鼠給藥后120 min與給藥前比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),C組小鼠給藥60,90 min痛閾值與給藥前比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);相同時(shí)間B組小鼠給藥60 min和D組小鼠給藥后90和120 min痛閾值比純化水組顯著提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),相同時(shí)間B組小鼠給藥后90,120 min和C組小鼠給藥后60,90及120 min痛閾值比純化水組顯著提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表5 6組小鼠熱板致痛反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of hot plate-induced pain test in six groups of mice ±s,n=10

表5 6組小鼠熱板致痛反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of hot plate-induced pain test in six groups of mice ±s,n=10

相同時(shí)間與純化水組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01;與本組給藥前比較,*3P＜0.01,*4P＜0.05Compared with purified water group at the same time,*1P＜0.05,*2P＜0.01;Compared with the same group before dosing,*3P＜0.01,*4P＜0.05

組別劑量/(mg·kg-1)給藥前痛閾值/s給藥后痛閾值/s 30 min60 min90 min120 min痛閾提高百分率/% 30 min60 min90 min120 min純化水017.4±5.614.0±5.515.1±3.113.5±7.216.8±8.40.00.00.00.0洛芬待因5020.0±7.815.3±5.122.3±6.5*135.8±9.8*2*328.0±7.9*10.011.579.040.0 A組50018.4±4.819.6±5.119.8±4.418.2±6.221.2±5.36.57.60.015.2 B組50020.6±8.014.4±5.026.0±11.4*136.0±9.0*2*339.8±12.8*2*30.026.274.893.2 C組50019.8±7.315.5±6.332.0±10.9*2*436.3±15.4*2*442.0±11.9*2*30.061.683.3112.1 D組50018.9±8.512.0±4.121.1±7.322.9±8.1*128.9±9.7*10.011.621.152.9

3 討論

筆者在本實(shí)驗(yàn)中采用二甲苯致小鼠耳腫脹、小鼠棉球肉芽腫等體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及各萃取物調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞分泌NO水平的體外實(shí)驗(yàn)篩選抗炎活性部位。通過(guò)小鼠熱板法、醋酸扭體評(píng)價(jià)和比較了瑤藥小鉆不同溶劑提取物的抗炎鎮(zhèn)痛效果。小鉆乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物均具有抗炎活性,能減少二甲苯致小鼠急性耳廓腫以及小鼠棉球肉芽腫的腫脹程度;小鉆乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物還具有明顯的鎮(zhèn)痛活性,能提高熱板致痛小鼠的痛閾,延緩熱板疼痛反應(yīng)時(shí)間,減少冰醋酸刺激致痛小鼠扭體次數(shù)。實(shí)驗(yàn)證明,小鉆乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物均具有抗炎鎮(zhèn)痛活性。本研究為瑤藥小鉆的綜合開(kāi)發(fā)利用和擴(kuò)大藥源提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] 戴斌.中國(guó)現(xiàn)代瑤藥學(xué)[M].南寧:廣西科學(xué)技術(shù)出版社, 2009:70-72.

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.005

Anti-inflammation and Analgesic Effects of the Extracts from Kasdsura Longipedunculata Finet et Gagnep

MO Dan-dan,TANG Bing-lan,ZHOU Xiao-lei,WANG Shuo,LIU Zhen-jie,GU Xiao-yu,YUAN Jing-quan
(Natural Medicine Research Laboratory of Chemical Composition Institute of Guangχi Medicinal Plant,Nanning 530023,China)

Objective To screen the anti-inflammatory and analgesic extracts fromKasdsura longipedunctulata Finet et Gagnepand provide theoretic basis for its further exploitation and utilization.MethodsDifferent extracts(petroleum ether extract,ethyl acetate extract,n-butyl alcohol extract,water extract)were prepared.Mice were randomly divided into normal control,positive control with aspirin(50 mg·kg-1)or ibuprofen codeine(containing codeine 6.76 mg·kg-1),and petroleum ether,ethyl acetate,butanol,water extract groups(at 500 mg·kg-1each).Extracts or controls were intragastrically administered once daily for 7 consecutive days.The anti-inflammatory part fromKasdsura longipedunctulata Finet et Gagnepwas screened through xylene-induced ear edema,granuloma grew in mice,and nitric oxide(NO)level detection in macrophage RAW264.7 cells induced by lipopolysaccharide(LPS).The analgesic action of the extracts were tested with the hot plate method and acetic acid writhing in mice.ResultsAll of ethyl acetate extracts,n-butanol extracts and water extracts significantly inhibited the mice auricle swelling caused by xylene and cotton ball granuloma in mice(P＜0.05 orP＜0.01),and obviously reduced the NO release from LPS induced RAW264.7 cells(P＜0.01),which manifesting certain anti-inflammatory activity.The three extracts significantly decreased acetic acid-induced writhing,and attenuated hot plate induced pain by raising the pain threshold in mice (P＜0.05 orP＜0.01).ConclusionAll of the ethyl acetate extract,n-butanol extract,and water extract fromKasdsura longipedunctulata Finet et Gagnepexert anti-inflammatory and analgesic activity.

Bradawl;Anti-inflammation;Analgesia

R286;R965

A

1004-0781(2014)03-0291-04

2013-07-19

2013-08-20

*國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAI27B06);瑤藥創(chuàng)新體系建立及廣西民族醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)化技術(shù)平臺(tái)建設(shè)(桂科能10100027-3);廣西生物醫(yī)藥創(chuàng)業(yè)服務(wù)平臺(tái)建設(shè)(桂科能10100024-4);廣西中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目(GZZY13-35)

莫單丹(1980-),女,廣西那坡人,研究實(shí)習(xí)員,學(xué)士,研究方向:中藥藥理。電話:0771-2443036,E-mail：modan991220@163.com。

袁經(jīng)權(quán)(1967-),男,廣西玉林人,副研究員,博士,研究方向:中藥新產(chǎn)品研發(fā)。電話:0771-5602461,E-mail：yjqgx@163.com。