周欣，陳華國(guó)，張明，楊世林

(貴州師范大學(xué)天然藥物質(zhì)量控制研究中心、貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550001)

·藥物制劑與藥品質(zhì)量控制·

刺梨高效液相色譜指紋圖譜研究*

周欣，陳華國(guó)，張明，楊世林

(貴州師范大學(xué)天然藥物質(zhì)量控制研究中心、貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550001)

目的 建立刺梨的高效液相色譜(HPLC)特征圖譜測(cè)定方法。方法采用反相高效液相色譜法,Hanbon Phecda C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B)為流動(dòng)相,梯度洗脫,流速1 mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)255 nm,柱溫:25℃;測(cè)定了14批刺梨藥材的指紋圖譜,應(yīng)用相似度分析和聚類分析方法對(duì)藥材進(jìn)行分類,建立指紋圖譜共有模式。結(jié)果建立了刺梨藥材的指紋圖譜測(cè)定方法及其特征圖譜,不同產(chǎn)地藥材圖譜具有一定差異性。結(jié)論刺梨HPLC特征圖譜的建立為藥材質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

刺梨；色譜法,高效液相；特征圖譜

刺梨(Rosa roχbughiiTratt.)為薔薇科植物繅絲花的果實(shí),曬干后入藥,是貴州苗族特色藥材,也是“藥食兩用”資源,藥用價(jià)值較高,作為原料藥已被廣泛用于民間驗(yàn)方、醫(yī)院制劑、中成藥、保健食品的配方［1-2］。目前以刺梨為主要原料生產(chǎn)的中成藥有血脂平膠囊、小兒消食開胃顆粒、康艾扶正膠囊等。同時(shí),刺梨具有較好的抗氧化、抗衰老、防癌抗癌、排鉛鎘等作用［3-5］,以其為主要原料開發(fā)出的刺梨飲料、刺梨茶、強(qiáng)化超氧化物歧化酶刺梨汁等一系列保健食品已經(jīng)成功上市。但是,通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),刺梨藥材質(zhì)量控制方面的研究基礎(chǔ)非常薄弱［6］,僅《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003年版)中以薄層來(lái)鑒別刺梨藥材［7］,質(zhì)量控制水平不高,不能有效控制刺梨藥材的質(zhì)量,無(wú)法滿足刺梨藥材發(fā)展應(yīng)用之需要。因此,筆者采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)刺梨藥材進(jìn)行指紋圖譜研究［8-10］,建立其指紋圖譜測(cè)定方法,并通過(guò)數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析,建立刺梨的HPLC特征圖譜,用以控制刺梨藥材的質(zhì)量,為刺梨藥材的品質(zhì)評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 U3000高效液相色譜儀(美國(guó)Dionex公司),HH-S4型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司),TD5M低速多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(濟(jì)南博鑫生物技術(shù)有限公司),KQ-250B型超聲波清潔器(昆山市超聲儀器有限公司),XS105DU型十萬(wàn)分之一電子天平［梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司］。

1.2 試藥 乙腈(TEDIA Company Inc.)為色譜純,磷酸為優(yōu)質(zhì)純,水為超純水,其余試劑均為分析純。沒(méi)食子酸對(duì)照品(批號(hào):110831-200803)由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供,原兒茶酸對(duì)照品(批號(hào):GZDD-0773-201201)由貴州迪大科技有限責(zé)任公司提供。刺梨藥材經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院陳德媛教授鑒定為Rosa roχbughiiTratt.的果實(shí),樣品來(lái)源及采集信息見表1。

表1 刺梨藥材采集信息Tab.1 Harvest information of Rosa roxbughii Tratt.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Hanbon Phecda C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm)；流動(dòng)相為A:乙腈,B: 0.05%磷酸溶液,梯度洗脫,洗脫程序見表2。檢測(cè)波長(zhǎng):255 nm；柱溫:25℃；流速:1 mL·min-1。

表2 洗脫程序Tab.2 Elution program %

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取沒(méi)食子酸、原兒茶酸適量,用甲醇配制成濃度分別為18.6,37.5μg·mL-1混合對(duì)照品溶液。

2.3 樣品溶液制備 稱取刺梨藥材粉末(過(guò)孔徑0.250 mm藥篩)1.0 g,置于150 m L具塞錐形瓶中,精密加入50%乙醇溶液20 mL,稱質(zhì)量,回流提取2 h后,補(bǔ)質(zhì)量,搖勻,濾過(guò),濾液轉(zhuǎn)移至50 mL的離心管中,離心(4 000 r·min-1)5 min,取10 mL上清液,揮干,用水20 mL分散,轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,用水飽和正丁醇溶劑萃取3次,每次20 mL,用正丁醇飽和的水20 mL洗脫萃取液3次,蒸干正丁醇溶液,用甲醇定容于10 mL量瓶中,搖勻,過(guò)孔徑0.45μm微孔濾膜,即得。

2.4 測(cè)定方法 精密量取上述混合對(duì)照品溶液和樣品溶液各10μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密稱取刺梨藥材粉末1 g,按照“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液,并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行操作,連續(xù)進(jìn)樣6次,以84 min色譜峰為參照,計(jì)算其相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.3%,相對(duì)峰面積的RSD為0.6%,表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同批刺梨藥材(貴陽(yáng)市息烽縣永靖鎮(zhèn))粉末6份,按“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液,考察色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性。以84 min色譜峰為參照,計(jì)算得知,相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<0.9%,相對(duì)峰面積的RSD均<1.7%,表明重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取刺梨藥材(貴陽(yáng)市息烽縣永靖鎮(zhèn))粉末1.0 g,按照“2.3”項(xiàng)方法制備樣品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,分別在0,4,8,24,36, 48 h進(jìn)樣,每次進(jìn)樣10μL,以84 min色譜峰為參照,計(jì)算得知,色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<0.7%,相對(duì)峰面積的RSD均<1.8%,表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 貴州地區(qū)刺梨藥材HPLC指紋圖譜指紋的建立 精密稱取刺梨藥材粉末1.0 g,按照“2.3”項(xiàng)方法制備樣品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”,進(jìn)行分析,參數(shù)設(shè)置:(a)參照?qǐng)D譜:采用1號(hào)樣品作為相似度計(jì)算時(shí)校正的參照?qǐng)D譜；(b)時(shí)間窗寬度:0.10；(c)校正方式:多點(diǎn)校正。校正色譜峰的確定:本品色譜圖中主要色譜峰在0～120 min內(nèi)基本分布均勻,為保證不同批次指紋圖譜匹配時(shí)校正準(zhǔn)確性,選擇了15個(gè)點(diǎn)進(jìn)行校正Mark峰,其中包括沒(méi)食子酸和原兒茶酸。(d)14批刺梨藥材色譜圖生成指紋圖譜見圖1,共有模式圖譜見圖2,相似度計(jì)算結(jié)果見表3。

2.7 聚類分析 利用SPSS18.0版軟件對(duì)14批不同產(chǎn)地的刺梨藥材進(jìn)行聚類分析,將14個(gè)樣品的20個(gè)共有峰面積作為特征,采用離差平方和法,以歐氏距離對(duì)樣品聚類,聚類分析樹狀圖見圖3。

圖1 14批刺梨藥材指紋圖譜疊加圖Fig.1 Overlap figure of fingerprint for 14 batches of Rosa roxbughii Tratt.

圖2 刺梨指紋圖譜共有模式及特征峰指認(rèn)1.沒(méi)食子酸;2.原兒茶酸Fig.2 Common pattern and unique peak of fingerprint of Rosa roxbughii Tratt.1.gallic acid;2.protocatechuic acid

表3 14批刺梨樣品的相似度結(jié)果Tab.3 Sim ilarity results of 14 batches of Rosa roxbughii Tratt.of sam p les

結(jié)果顯示:14個(gè)樣品中,樣品被分成A、B兩大類,各自又分為A1、A2、B1、B2四大類。閾值=4時(shí),可分為五類:第一類包括12,13,14號(hào)藥材；第二類包括1, 5,8號(hào)藥材；第三類包括3,6,7,9,11號(hào)藥材；第四類包括2號(hào)藥材；第五類包括4號(hào)藥材。其中,A類藥材主要集中分布于貴州省中部及北部地區(qū),B類藥材主要集中分布于貴州省西部地區(qū)的畢節(jié)和六盤水。

圖3 聚類分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram of cluster analysis

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,對(duì)甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、無(wú)水乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇等溶劑進(jìn)行了考察,結(jié)果表明,不同溶劑提取物的HPLC圖譜在指定的色譜分析條件下檢視,記錄色譜圖,比較各溶劑提取得到的色譜峰數(shù)量及峰面積大小,結(jié)果表明提取溶劑極性對(duì)提取效果影響較大,50%乙醇提取效果較好,選用其作為提取溶劑。

3.2 溶劑用量 分別考察了20,40,60 mL溶劑對(duì)圖譜的影響,研究結(jié)果顯示,隨著提取溶劑量的增加對(duì)藥材提取效率無(wú)顯著影響,故提取溶劑用量選擇20 mL。

3.3 提取溫度 分別考察了60,70,80,90℃水浴下回流提取,研究結(jié)果顯示,隨著提取溫度的升高,色譜圖的數(shù)量及峰面積有所增加,但當(dāng)溫度為90℃時(shí),有部分成分分解,所以采用提80℃水浴提取。

3.4 提取時(shí)間 分別考察了提取0.5,1.0,1.5,2.0, 2.5 h對(duì)圖譜的影響,結(jié)果顯示,提取時(shí)間由0.5 h變?yōu)? h,主要峰峰面積增加不大,再延長(zhǎng)到2.5 h時(shí),主要峰的峰面積有降低的趨勢(shì),可能的原因是化合物被分解,所以選擇2 h作為提取時(shí)間。

3.5 提取次數(shù) 分別考察了提取1,2,3次對(duì)圖譜的影響,結(jié)果顯示,提取2次與提取1次的效率差異不大,提取次數(shù)再次增加,峰面積幾乎無(wú)變化,故選擇提取1次。

3.6 萃取方法 由于刺梨果實(shí)的產(chǎn)地、采收期、存放時(shí)間不同,藥材中糖類、有機(jī)酸等大極性物質(zhì)的含量差異較大,響應(yīng)值較高,影響圖譜整體效應(yīng),所以采用萃取去除大極性的物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以乙酸乙酯、正丁醇作為萃取溶劑,方法1:取回流提取液10 m L,蒸干后,用水20 mL分散,每次用乙酸乙酯25 mL提取、萃取2次,合并萃取溶劑,蒸干后,用甲醇溶液定容到10 m L量瓶中,混勻,微孔濾膜過(guò)濾,進(jìn)樣；方法2:采用水飽和正丁醇萃取,其余條件同方法1；方法3:將方法2得到水飽和正丁醇萃取液轉(zhuǎn)移至分液漏斗,每次用正丁醇飽和的水20 m L進(jìn)行洗脫,洗脫3次后的正丁醇萃取液,按上述方法進(jìn)行操作；方法4:用正丁醇飽和的水20 mL進(jìn)行洗脫2次,其余部分均按方法3操作。研究結(jié)果顯示,與未萃取樣品色譜圖比較,各方法所得到的圖譜,除方法3前段大極性物質(zhì)色譜峰較小之外,后部分的峰個(gè)數(shù)及峰面積差異較小,故選擇方法3作為萃取方法。

3.7 色譜柱 共考察了4根不同的色譜柱,分別為: Hanbon Phecda C18(250 mm×4.6 mm,5μm)、Hanbon Lichrospher C18(250 mm×4.6 mm,5μm)、Phenomenex Synergi Fusion-RP 80A(250 mm×4.6 mm,4μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)。在選定的相同色譜條件下進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果顯示,Hanbon Phecda C18柱的分離效果最好,柱效較高,故選擇Hanbon Phecda C18柱進(jìn)行刺梨指紋圖譜的檢測(cè)。

3.8 色譜流動(dòng)相 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,對(duì)乙腈-水、乙腈-水(0.2%甲酸)、乙腈-水(0.2%醋酸)、乙腈-水(0.05%磷酸)、甲醇-水(0.5%磷酸)四組流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行篩選,結(jié)果表明,不同流動(dòng)相中,以乙腈-水(甲酸)的梯度洗脫系統(tǒng)效果最佳,色譜圖上各個(gè)色譜峰的分離度良好,基線最穩(wěn),保留時(shí)間適中。

3.9 檢測(cè)波長(zhǎng) 利用DAD二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,兼顧到所有色譜峰的吸收值,故選擇255 nm作為刺梨HPLC指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng),該檢測(cè)波長(zhǎng)下出峰較多,反映的信息較完全；各個(gè)峰吸收值良好,基線平穩(wěn),也避免了近紫外雜質(zhì)峰的影響。

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DOI 10.3870/yydb.2014.01.024

Study on HPLC Fingerp rint of Rosa Roxbughii Tratt.

ZHOU Xin,CHEN Hua-guo,ZHANG Ming,YANG Shi-lin
(The Research Center for Quality Control of Natural Medicine,Guizhou Normal University,Key Laboratory for Information System of Mountainous Areasand Protection of Ecological Environment,Guizhou Province,Guiyang 550001,China)

Objective To establish an HPLCmethod for determining fingerprint ofRosa roχbughii.MethodsThe HPLCmethod was used with Hanbon Phecda C18column(250 mm×4.6 mm,5μm).Themobile phase consists of acetonitrile (A)and 0.05%phosphoric acid(B)with a gradient elution.The column temperature was set at 25℃,and the detective wavelength was 255 nm.The HPLC fingerprint for 14 batches ofRosa roχbughiiwas studied.The similarity analysis and cluster analysiswere taken to classify the herbs and establish a common pattern of fingerprints.ResultsA HPLC method for determination of ingredients inRosa roχburghiitratt and the fingerprintwere established.A unique fingerprintwas presented for herbs from different areas.ConclusionThe establishment of HPLC feature fingerprint ofRosa roχburghiiTratt provides scientific basis for herbs quality control.

Rosa roχbughiiTratt;Chromatography,high performance liquid;Feature fingerprint

R282.71;R284

A

1004-0781(2014)01-0082-04

2013-04-03

2013-05-21

*“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2011BAC09B01)；貴州省國(guó)際合作項(xiàng)目(黔科合外G［2012］7024號(hào))；貴州省科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(黔科合人才團(tuán)隊(duì)(2011)4008)；貴州省教育廳特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(黔科合KY［2012］005號(hào))；貴陽(yáng)市科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目(筑科合同［2012401］社-4號(hào))

周欣(1962-),女,貴州貴陽(yáng)人,教授,博士,研究方向:中藥、民族藥質(zhì)量控制、中藥指紋圖譜以及中藥新藥研發(fā)。電話：0851-6700414,E-mail：alice9800@sina.com。