黎建緒，鄭雅梅，胡曉燕，滕凱，曹如波，劉莉

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心，武漢 430023)

艾迪注射液對(duì)小鼠放射性肺損傷的防治作用

黎建緒，鄭雅梅，胡曉燕，滕凱，曹如波，劉莉

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心，武漢 430023)

目的觀察艾迪注射液在放射性肺損傷中的防治作用,并探討其相關(guān)機(jī)制。方法將SPF級(jí)C57BL/6小鼠120只隨機(jī)分為4組:空白對(duì)照組,照射+艾迪組,照射+甲潑尼龍組和照射組,每組30只。給予小鼠單次12 Gy胸部照射以建立放射性肺損傷模型,照射前2 h及以后每日腹腔注射艾迪及甲潑尼龍。分別于照射后1,24,72 h及1,2,4,8, 16和24周處死小鼠,取左肺固定做組織切片,行蘇木精-伊紅(HE)染色觀察病理變化、Masson染色觀察膠原形成和免疫組化檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)蛋白含量,取右肺行Western-blot測(cè)定TGF-β1蛋白含量,Real-time聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測(cè)定TGF-β1mRNA含量。結(jié)果小鼠在接受照射后于1～2周出現(xiàn)放射性肺炎表現(xiàn),TGF-β1mRNA和蛋白含量升高,但在給予艾迪注射液和甲潑尼龍?zhí)幚斫M中TGF-β1mRNA和蛋白相對(duì)含量較照射組少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),照射+艾迪組和照射+甲潑尼龍組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在照射后16及24周觀察到纖維形成增加,但照射+艾迪組和照射+甲潑尼龍組較照射組少。結(jié)論艾迪注射液和甲潑尼龍可以下調(diào)因照射引起的TGF-β1mRNA和蛋白含量上升,二者在此作用上未觀察到差別,這可能是其減輕放射性肺損傷的關(guān)鍵。

艾迪注射液；損傷,肺,放射性；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

放射治療(放療)是胸部惡性腫瘤治療的主要方法之一,但由于在放療過程中部分肺組織不可避免地受到照射,且肺是放射敏感器官,因此由放療引起放射性肺損傷成為胸部腫瘤治療的一個(gè)常見并發(fā)癥,這不但影響放療劑量進(jìn)而影響腫瘤治療效果,還降低患者生活質(zhì)量甚至危及生命。放射性肺損傷分為放射性肺炎(放療后1～3個(gè)月)和放射性肺纖維化(放療后數(shù)月至數(shù)年)。國(guó)內(nèi)外許多研究證明抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的生成可以緩解放射性肺損傷癥狀并改善的程度。臨床上放射性肺炎的治療藥物仍然主要是大劑量糖皮質(zhì)激素,但其易致腫瘤復(fù)發(fā),不良反應(yīng)多,而放射性肺纖維化至今仍無(wú)特效藥物［1-2］。近年來(lái),中藥在防治放射性肺損傷中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。臨床研究表明一些具有清熱解毒、養(yǎng)陰益氣、活血化瘀功效的中藥具有不同程度的預(yù)防和治療放射性肺損傷的作用［3］。筆者觀察了艾迪注射液對(duì)小鼠放射性肺損傷的預(yù)防和治療作用,對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)8周齡C57BL/6雌鼠120只,體質(zhì)量(20±2)g,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,飼養(yǎng)于SPF級(jí)小鼠飼養(yǎng)室。

1.2 試藥 艾迪注射液(貴州益佰制藥股份有限公司,批號(hào):20111020),其組方為斑蝥、人參、黃芪、刺五加。艾迪注射液10 mL加0.9%氯化鈉溶液稀釋20 mL配成工作液,腹腔注射0.15 mL·(10 g)-1(生藥3.75 g·kg-1)；甲潑尼龍［甲潑尼龍琥珀酸鈉,法瑪西亞普強(qiáng)(中國(guó))有限公司產(chǎn)品,批號(hào):20111123］,甲潑尼龍40 mg加0.9%氯化鈉溶液至64.5 mL配成工作液,腹腔注射0.15 mL·(10 g)-1(9.3 mg·kg-1)。兔抗小鼠TGF-β1一抗(BioVision,CA 94043 USA),山羊抗兔二抗(Proteintech Group),ReverTra Ace-α-(Code No:FSK-100,toyobo),SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa,Code:DRR420A),

1.3 儀器 免疫組化試劑盒(中杉金橋,SP9001), TRIzol Reagent(Invitrogen,15596026),ABI StepOnePlusTM,六一電泳儀(北京,DYCZ-24DN), OLYMPUS TH4-200。

1.4 動(dòng)物分組與造模 小鼠隨機(jī)分為4組(空白對(duì)照組,照射+艾迪組,照射+甲潑尼龍組和照射組),照射前小鼠腹腔注射10%水合氯醛0.06 mL麻醉,麻醉后采用自治固定裝置固定,仰臥于治療床。SSD＝100 cm,射野40 cm×3 cm,d＝3 cm,雙肺中平面單次照射12 Gy,建立小鼠放射性肺損傷模型［4］。照射前2 h和照射后每日同一時(shí)間予艾迪注射液或甲潑尼龍腹腔注射,于照射后1,24,72 h及1,2,4,8,16和24周各組分別隨機(jī)取3只小鼠處死,左肺用4%多聚甲醛固定2 d后包埋,右肺分3塊后置-80℃保存以提蛋白做Western-blot或提RNA做逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative reverse transcripiase polymerase chain reaction,Real-time RT-PCR)。

1.5 組織病理檢查 常規(guī)蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色,光鏡下觀察病理組織結(jié)構(gòu)。16和24周小鼠行Masson染色觀測(cè)膠原含量。

1.6 免疫組化 用包埋的組織做切片,在二甲苯中脫蠟和梯度乙醇溶液中再水化,放在枸櫞酸鹽中96℃1 h抗原修復(fù),封閉15 min后加入兔抗小鼠TGF-β1一抗(稀釋比1∶20),4℃過夜,用過氧化氫(H2O2) 37℃20 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶,加入二抗37℃ 30 min后加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37℃30 min,在顯微鏡下控制二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)染色時(shí)間后蘇木精6 s染核,脫水并封片。免疫組化半定量評(píng)分法［5］,0分:無(wú)著色,與背景色一致,陽(yáng)性細(xì)胞比例<5%,陰性(細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒為陽(yáng)性)；1分:淺黃色,略高于背景色,陽(yáng)性細(xì)胞率<10%；2分:棕黃色,明顯高于背景色,陽(yáng)性細(xì)胞率為～50%；3分:棕褐色,陽(yáng)性細(xì)胞率為～75%；4分:陽(yáng)性細(xì)胞率為>75%。

1.7 Real-time RT-PCR 主要步驟:在研磨器中加入TRIzol并研磨組織后提總RNA,后按ToYoBo FSK-100說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,按SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)說明加試劑后行兩步法PCR反應(yīng),反應(yīng)條件如下:預(yù)變性95℃30 s,擴(kuò)增條件95℃5 s,60℃35 s,重復(fù)40個(gè)循環(huán)。引物序列如下:β-actin上游引物GCATTGCT-GACAGGATGCAG下游引物CCTGCTTGCTGATCCACATC,TGF-β1上游引物TGCGCTTGCAGAGATTAAAA,下游引物AGCCCTGTATTCCGTCTCCT。引物序列經(jīng)Premier 5.0和Oligo7設(shè)計(jì)驗(yàn)證。

1.8 Western-blot 在研磨器中加入RIPA蛋白裂解液研磨溶解組織后提取總蛋白,加樣后在濃縮膠和分離膠中電泳分離蛋白,在轉(zhuǎn)膜液中用0.45μm聚偏氟乙烯樹脂［poly(vinylidene fluoride),PVDF］膜150 mA轉(zhuǎn)膜100 min,5%牛奶封閉1 h后覆一抗4℃過夜,覆二抗1 h后行電致化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)顯色反應(yīng)。結(jié)果用Gel-Pro analyzer軟件讀出內(nèi)參、目的積分灰度值(IA),相對(duì)含量即為目的積分灰度值/內(nèi)參積分灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS18.0版軟件進(jìn)行分析,運(yùn)用單向方差分析(ANOVA)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì),當(dāng)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)改變 HE染色在空白對(duì)照組未觀察到肺泡炎改變,無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡間隔未見增厚；而所有接受照射的小鼠從72 h到1周起出現(xiàn)肺泡壁水腫、充血,并有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡間隔增厚,照射+艾迪組和照射+甲潑尼龍組一般為0～1級(jí)肺泡炎表現(xiàn),而照射組則一般表現(xiàn)為2～3級(jí)肺泡炎。Masson染色在空白對(duì)照組未觀察到明星膠原沉積,所有接受照射小鼠的膠原明顯增多,但照射+艾迪組和照射+甲潑尼龍組明顯較照射組少,而這兩組之間無(wú)明顯差別。見圖1,2。

2.2 免疫組化 空白對(duì)照組支氣管上皮呈不均一表達(dá),肺實(shí)質(zhì)少量肺泡巨噬細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá),而血管內(nèi)皮和肌層均呈陰性。所有接受照射的小鼠在照射后72 h和2,4,8,16和24周均可見大量肺泡巨噬細(xì)胞和Ⅱ型肺泡細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá),還可見許多陽(yáng)性纖維母細(xì)胞增生,以16周明顯。以免疫組化半定量評(píng)分法計(jì)算,照射后1,2,4,8,16和24周所有照射的小鼠TGF-β1含量明顯升高,在8和16周達(dá)到高峰,除1周外,照射組TGF-β1含量較照射+艾迪組和照射+甲潑尼龍組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),同時(shí)在72 h,照射組也較照射+艾迪組和照射+甲潑尼龍組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。照射+艾迪組和照射+甲潑尼龍組TGF-β1含量在任一時(shí)間點(diǎn)均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3,4。

2.3 Real-time RT-PCR 照射后1,2,4,8和16周時(shí)照射+艾迪組和照射+甲潑尼龍組肺組織TGF-β1mRNA的表達(dá)較照射組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,照射+艾迪組和照射+甲潑尼龍組肺組織TGF-β1mRNA的表達(dá)在任一時(shí)間均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但仍高于空白對(duì)照組,所有受到照射小鼠的TGF-β1mRNA表達(dá)在照射后8周達(dá)到最高峰。見圖5。

圖1 4組小鼠1周時(shí)肺組織HE染色(×400)A.空白對(duì)照組;B.照射+艾迪組;C.照射+甲潑尼龍組;D.照射組Fig.1 HE staining on lung tissues of four groups ofmice after one weekA.black control group;B.Aidi injection plus radiation group;C.Solu Medrol plus radiation group;D.radiation group

圖2 4組小鼠24周時(shí)Masson染色(×400)A.空白對(duì)照組;B.照射+艾迪組;C.照射+甲潑尼龍組;D.照射組Fig.2 Masson staining on four groups of mice after 24 weeksA.black control group;B.Aidi injection plus radiation group;C.Solu Medrol plus radiation group;D.radiation group

圖3 4組小鼠8周時(shí)免疫組化圖A.空白對(duì)照組;B.照射+艾迪組;C.照射+甲潑尼龍組;D.照射組Fig.3 Immunohistochemical staining on four groups ofmice after eight weeksA.black control group;B.Aidi injection plus radiation group;C.Solu Medrol plus radiation group;D.radiation group

圖4 4組小鼠免疫組化半定量評(píng)分法計(jì)算得到的TGF-β1表達(dá)量

圖5 4組TGF-β1mRNA含量

2.4 Western-blot 照射組在照射后8和16周檢測(cè)到TGF-β1蛋白相對(duì)含量(目的IA/內(nèi)參IA)較照射+艾迪組和照射+甲潑尼龍組高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有受到照射小鼠的TGF-β1蛋白相對(duì)含量均較空白對(duì)照組增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,然而也觀察到照射+艾迪組在16周TGF-β1蛋白相對(duì)含量較照射+甲潑尼龍組減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

圖6 4組在8和16周用W estern blot檢測(cè)到TGF-β1表達(dá)量A.空白對(duì)照組;B.艾迪+照射組;C.甲潑尼龍+照射組;D.照射組Fig.6 TGF-β1protein expression in four groups of mice after 8 weeks and 16 weeksA.black control group;B.Aidi injection plus radiation group; C.Solu Medrol plus radiation group;D.radiation group

3 討論

放射性肺炎是由免疫介導(dǎo)的產(chǎn)生雙側(cè)淋巴細(xì)胞性肺泡炎和局部放射反應(yīng),其病理學(xué)基礎(chǔ)是射線直接作用于DNA,導(dǎo)致基因和大分子化合物的損傷以及脂質(zhì)過氧化作用的間接啟動(dòng)凋亡途徑和炎癥的級(jí)聯(lián)效應(yīng)［6-7］。放射性肺纖維化則是在急性放射性肺炎發(fā)生的遷延,由損傷的靶細(xì)胞(主要是肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等肺內(nèi)效應(yīng)細(xì)胞)釋放多種細(xì)胞因子,尤其是促纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子,如TGF-β1、PDGF、FGF等,啟動(dòng)成纖維細(xì)胞的增殖分裂,促進(jìn)膠原蛋白的大量合成,最終形成膠原沉積［8-9］。許多研究表明肺部受照射后,多種細(xì)胞因子合成增加,特別是白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6、TGF-β1和腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factorα,TNF-α)［10］。進(jìn)一步研究顯示, TGF-β1是誘發(fā)放射性肺纖維化的關(guān)鍵因素,具有強(qiáng)促纖化作用,它主要作用于膠原的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程,加速肺纖維化的發(fā)生,并能趨化炎性細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞,誘導(dǎo)其合成釋放PDGF、TNF、IL-1、IL-6等細(xì)胞因子,擴(kuò)大生物效應(yīng)［11］。綜上所述,細(xì)胞因子尤其是TGF-β1的致炎及纖維化作用及其產(chǎn)生的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)是導(dǎo)致放射性肺損傷和纖維化的重要機(jī)制。研究也表明,通過有效的干預(yù)策略,放射性肺損傷的病程或病理學(xué)改變可被有效逆轉(zhuǎn),而阻斷TGF-β1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或降低TGF-β1的表達(dá)無(wú)疑是應(yīng)高度關(guān)注的靶點(diǎn)［12］。

目前臨床上主要治療放射性肺炎的藥物仍是大劑量糖皮質(zhì)激素,但由于糖皮質(zhì)激素長(zhǎng)期使用易致腫瘤復(fù)發(fā)、多種不良反應(yīng)產(chǎn)生,而放射性肺纖維化至今仍無(wú)特效藥物。故亟需尋找能防治放射性肺損傷且不良反應(yīng)少的藥物。多數(shù)中藥以不良反應(yīng)輕著稱,可能在防治放射性肺損傷上有一定優(yōu)勢(shì)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為放射線是一種熱毒燥邪,放射性肺纖維化乃因熱毒內(nèi)侵、灼傷肺絡(luò)、傷津耗氣,進(jìn)而導(dǎo)致血絡(luò)瘀阻。治療上主要有清熱解毒、益氣養(yǎng)陰和活血化瘀3種方法［13-15］。本實(shí)驗(yàn)組成員也重點(diǎn)研究中藥在放射性肺損傷中的作用,研究表明參芪扶正液具有下調(diào)TGF-β1和TNF-α的作用從而發(fā)揮防治放射性肺損傷作用［16-17］。艾迪注射液中的黃芪、人參具有不同程度的抗氧化和清除自由基的作用,從而減少射線造成的過氧化損傷,減輕放射性肺損傷；斑蝥有攻毒蝕瘡,破血散結(jié)的作用能改善血液循環(huán)作用,而起到抑制膠原纖維合成及抗纖維化作用,此外其還可通過影響與放射性肺炎有關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)而發(fā)揮作用［18］。

在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,艾迪注射液與甲潑尼龍顯示出減輕放射性肺損傷的作用。照射組小鼠的肺HE染色顯示放射性肺炎程度較空白對(duì)照組、照射+艾迪組和照射+甲潑尼龍組明顯嚴(yán)重；照射組小鼠膠原形成較其他3組明顯增多；在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)照射組小鼠TGF-β1蛋白及mRNA水平較其他3組增多。在16周Westernblot測(cè)定提示可能艾迪在防治放射性纖維化較甲潑尼龍的作用更強(qiáng)。艾迪注射液防治放射性肺損傷的作用機(jī)制可能為通過影響細(xì)胞因子表達(dá),從而抑制關(guān)鍵因子TGF-β1的轉(zhuǎn)錄和翻譯,使其表達(dá)量減少。其相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

總之,本研究表明艾迪注射液可以在一定程度上防治小鼠放射性肺損傷,其作用與甲潑尼龍相似。

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DOI 10.3870/yydb.2014.02.013

Preventive and Therapeutic Effect of Aidi Injection on Radiation-Induced Lung Injury

LI Jian-xu,ZHENG Ya-mei,HU Xiao-yan,TENG Kai,CAO Ru-bo,LIU Li
(Cancer Center,Union Hospital, Tongji Medical College,Huazhong University ofScience and Technology,Wuhan 430023,China)

Objective To study the effect ofaidiinjection on radiation-induced lung injury and the probable Mechanism.MethodsOne hundred and twenty C57BL/6 mice were exposed to either shamradiation or single fraction of 12 Gy delivered to the thorax.Four groupswere defined as follows:in normal controlgroup,themice received neither radiation nor drug;inaidiinjection+radiation group,the mice received radiation andaidiinjection;in Solu Medrol+radiation group,the mice received Solu Medrol;in radiation group,themice were exposed to radiation.Aidi or Solu Medrolwere injected intraperitoneally 2 h before the radiation and daily after the radiation.Mice were sacrificed 1,24,72 hours,1,2,4,8,16 and 24 weeks after radiation.The left lungs were fixed and sectioned.The sections were stained by haematoxylin and eosin,masson stain and immunohistochemical stain for transforming growth factorβ1(TGF-β1).The right lungs were collected to detect TGF-β1mRNA expression by real-time quantitative reverse transcipiase polymerase chain reaction(RT-PCR)and TGF-β1protein expression by Western blotting.ResultsPneumonitis developed 1 to 2 weeks after radiation.Their TGF-β1mRNA and protein expression levels in radiation-treated mice were significantly higher than those in normal control group(bothP<0.05).But the effectswere reversed byaidiand Solu Medrol treatment(P<0.05).The TGF-β1mRNA and protein expression levels were not significantly different betweenaidiand Solu Medrol treatment.ConclusionBothaidiinjection and Solu Medrol can significantly downregulate TGF-β1mRNA and protein expression levels in the lungs of mice with radiation-induced lung injury.There is no significant difference in the effect betweenaidiinjection and Solu Medrol.

Aidiinjection;Injury,radiation,lung;Transforming growth factor-1

R286;R965

A

1004-0781(2014)02-0184-05

2013-01-14

2013-04-03

黎建緒(1986-),男,廣西梧州人,碩士,研究方向:惡性腫瘤早期診斷。電話:(0)15871492176,E-mail：lijianxu1236@163.com。

劉莉,女,教授,主任醫(yī)師,博士生導(dǎo)師,博士,從事腫瘤診治工作。電話:(0)13720378323,E-mail：liulixiehe2004@163.com。