李磊，王長遠(yuǎn)，蔡蕓，高鵬程，田燕，劉克辛

(大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，大連 116044)

·藥物研究·

羥絲肽口服微乳的制備與體內(nèi)藥動學(xué)研究*

李磊，王長遠(yuǎn)，蔡蕓，高鵬程，田燕，劉克辛

(大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，大連 116044)

目的制備羥絲肽(JBP 485)口服微乳,并考察其形態(tài)、穩(wěn)定性及體內(nèi)藥動學(xué)性質(zhì)。方法采用偽三元相圖繪制法來篩選JBP 485微乳制備的處方,以微乳的載藥量、穩(wěn)定性及黏度作為綜合評定的指標(biāo),優(yōu)選最佳處方。給大鼠分別灌胃JBP 485水溶液和JBP 485微乳,比較藥物在大鼠體內(nèi)的生物利用度。結(jié)果篩選出JBP 485微乳的最佳處方,以三油酸甘油酯-單辛/癸酸甘油酯(ODO-L)-乙醇-水(Km＝1∶1)體系作為JBP 485微乳的載藥體系,JBP 485微乳熱力學(xué)穩(wěn)定性良好,粒徑60～120 nm,載藥量35μg·mL-1。藥動學(xué)結(jié)果表明所制備的JBP 485微乳在大鼠體內(nèi)的相對生物利用度達(dá)到191.3%。結(jié)論制備的JBP 485微乳穩(wěn)定性良好,相對于水溶液,生物利用度有較明顯的提高。

羥絲肽；微乳；偽三元相圖；生物利用度；藥動學(xué)

羥絲肽(JBP 485)為環(huán)狀-反式-4-左旋-羥脯氨酸-左旋絲氨酸是一種二肽化合物,最初從日本抗肝炎藥物L(fēng)aennec(人胎盤水解產(chǎn)物)中分離,目前已人工合成［1］。JBP 485具有良好的抗肝炎活性,是水溶性好的小分子藥物,相對分子質(zhì)量約200［2-3］。大鼠口服給藥后,半衰期(t1/2)只有30～40 min,口服吸收不完全,生物利用度約為30%,口服時(shí)需要頻繁給藥［4］。有研究表明,肽類化合物制成油包水微乳后,藥物在胃腸道內(nèi)的穩(wěn)定性和滲透性都增強(qiáng),生物利用度顯著提高［5］。為了解決JBP 485口服生物利用度較低的問題,筆者擬將JBP 485制備成油包水型微乳,以達(dá)到減緩藥物釋放,提高生物利用度的目的。

1 材料與儀器

1.1 材料 JBP 485(含量>99.0%,株式會社日本生物制劑公司人工合成)；三油酸甘油酯(上海佳和生物科技有限公司)；肉豆蔻酸異丙酯(IPM,浙江物美生物科技有限公司)；司盤80(Span 80,江蘇海安石油化工廠)；聚山梨酯80(Tween80,廣州市西陸化工有限公司)；辛癸酸甘油單酯(Miglyol,濟(jì)南聯(lián)誼化工有限公司)；單辛/癸酸甘油酯(ODO-L,江蘇海安石油化工廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 JBP 485微乳的制備［6］

2.1.1 微乳偽三元相圖的繪制 使用加水滴定法繪制微乳的偽三元相圖。在室溫下,將表面活性劑與助表面活性劑按一定質(zhì)量比(Km)混合并置于西林瓶中,按照表面活性劑和助表面活性劑的混合物與油相的不同質(zhì)量比(分別為1∶9,2∶8,3∶7,4∶6,5∶5,6∶4, 7∶3,8∶2,9∶1)向混合物中加入油相,在磁力攪拌器攪拌下,滴加純化水,根據(jù)體系的變化來確定微乳區(qū)的界限。當(dāng)形成微乳時(shí),表現(xiàn)為透明或略帶乳光的液體,偏光顯微鏡下觀察無雙折射現(xiàn)象時(shí)；當(dāng)體系變渾濁或黏度增大,則表明體系已不再是微乳。計(jì)算每組分在滴定終點(diǎn)處在微乳體系中的質(zhì)量百分含量。固定Km值,用等邊三角形的一個(gè)邊表示表面活性劑和助表面活性劑的混合物(E),其余兩個(gè)邊分別表示油相(O)和水相(W),借助OriginPro7.5軟件繪制微乳的偽三元相圖。

2.1.2 乳化劑的選擇 通過單因素考察,選擇三油酸甘油酯作為油相。根據(jù)W/O微乳的性質(zhì),乳化劑的表面活性劑的親水親油平衡值(HLB值)應(yīng)為4～7之間為宜［7］。將ODO-L、Span80-Tween80(5∶1)作為備選乳化劑,與油相三油酸甘油酯和助乳化劑乙醇組成不同的微乳體系,選擇一定的Km(Km＝1∶2),按照上述方法,分別繪制不同微乳體系的偽三元相圖。在相圖中,相同的油相條件下,微乳的范圍越大,說明乳化劑容納水的能力越強(qiáng),載藥量也就越高。而同時(shí)應(yīng)該選擇黏度較小的乳化劑,使藥物流動性增加,便于服用。其中容納水量的多少是主要考慮因素,由于乳化劑ODO-L對水的容納能力略大于混合乳化劑Span 80-Tween 80,并且黏度較小,因此選擇ODO-L為乳化劑。

2.1.3 制備微乳中Km值的選擇 擬定Km分別為1∶2,1∶1和2∶1,分別以三油酸甘油酯為油相、ODO-L為乳化劑、乙醇為助乳化劑的微乳體系的偽三元相圖,考察Km對微乳相行為的影響。見圖1。隨著Km值的增大,整個(gè)微乳體系對水的容納能力略有增加,考慮到適當(dāng)減少表面活性劑的用量,所以,選擇Km值1∶1為最終Km值。

2.1.4 微乳制劑的制備 取三油酸甘油酯1.849 g,乳化劑ODO-L 3.565 g和助乳化劑無水乙醇3.565 g,在室溫下磁力攪拌均勻,得油相；稱取JBP 485 42 mg,超聲溶解于去離子水1.2 mL,配制成35 mg·mL-1的藥物溶液,得水相。將水相1 mL在室溫下滴入油相中,攪拌混勻,制得外觀澄清的油狀溶液。

2.2 微乳制劑的鑒別及穩(wěn)定性考察

2.2.1 微乳類型的鑒別及形態(tài)觀察 通過蘇丹紅和亞甲藍(lán)染料在JBP 485微乳中的擴(kuò)散試驗(yàn),可見油溶性染料蘇丹紅的擴(kuò)散速度大于水溶性染料亞甲藍(lán)的擴(kuò)散速度,說明微乳類型為W/O型。將JBP 485微乳滴入水中后成油滴狀,進(jìn)一步證明微乳類型為W/O型。采用透射電鏡觀察微乳的表面形態(tài)。將微乳油滴稀釋一定倍數(shù),用吸管將樣品滴至覆有支持膜的銅篩網(wǎng)上,用2%磷鎢酸染色劑染色,用濾紙吸走多余的液體,室溫靜置30 min晾干,透射電鏡下觀察微乳形態(tài),并拍攝照片,HV＝120 kV,見圖2。

2.2.2 微乳的物理穩(wěn)定性考察 將JBP 485微乳樣品放入高速離心機(jī),分別離心30 min(2 000 r·min-1)以及10 min(5 000 r·min-1),取出微乳樣品,觀察樣品外觀,如果仍為均一澄清的溶液,無分層也無藥物析出,說明微乳的體外物理穩(wěn)定性較好［8-9］。

觀察組和對照組均采用標(biāo)準(zhǔn)的化療方案，對獲得CR的急性髓細(xì)胞性白血病的緩解后治療，主要包括表柔紅霉素+阿糖胞苷（DA）、高三尖杉酯醇+阿糖胞苷（HA）、米托蒽醌+阿糖胞苷（MA）、阿霉素+阿糖胞苷（AA）及中/大劑量阿糖胞苷（Ara-C）等方案；對獲得CR的急性淋巴細(xì)胞白血病患者的緩解后治療，主要包括長春新堿+柔紅霉素+環(huán)磷酰胺+強(qiáng)的松（VDCP）、足葉乙苷+阿糖胞苷（EA）以及甲氨蝶呤（HD-MTX）等方案。觀察組加用十一味參芪片（吉林金恒制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z10900029，0.3 g/片）口服，每日服用3次，每次服4粒。

2.3 微乳的大鼠體內(nèi)藥動學(xué)研究

圖1 三油酸甘油酯/ODO-L/無水乙醇/水微乳體系偽三元相圖(25℃)A.Km＝1∶2；B.Km＝1∶1；C.Km＝2∶1Fig.1 Pseudo-ternary phase diagrams of the systemof glycerol trioleate/ODO-L/EtOH/H2O(25℃)A.Km＝1∶2；B.Km＝1∶1；C.Km＝2∶1

圖2 JBP 485微乳的透射電鏡照片(×50 000)Fig.2 Transmission electron microscopy micrographs of JBP 485microemulsion(×50 000)

2.3.1 液相-質(zhì)譜串聯(lián)(LC-MS/MS)條件 API 3200質(zhì)譜儀,離子源為電噴霧電離子源(ESI),掃描方式采用正離子掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(MRM),離子噴射電壓(IS)為3 000 V,霧化氣溫度(TEM)為610℃；氣簾氣壓力(cur)為140 kPa,碰撞氣(CAD)為14 L·min-1；源內(nèi)氣流速(GS1,N1)為45 L·min-1,源內(nèi)氣流速(GS2,N2)為30 L·min-1,用于定量分析的離子對為m/z 201.1→86.1(JBP 485),碎裂電壓:22 V。Agilent公司高效液相色譜儀,1200 series［10］。色譜柱:伊利特Hypersil ODSC18(2.1 mm×150 mm,5μm)；色譜柱設(shè)定溫度:室溫；流動相:0.1%甲酸水溶液-甲醇溶液(97∶3)；流速:0.5 mL·min-1；進(jìn)樣體積:10μL。

2.3.2 血漿樣品處理方法 取血漿100μL置1.5mL Ep管內(nèi),精密加入甲醇400μL,渦漩30 s,11 300×g離心10 min,取上清液400μL置Ep管中,40℃水浴中氮?dú)鈸]干后,用流動相200μL復(fù)溶,6 200×g離心10 min后,取上清液10μL,按上述色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)行LC-MS/MS測定。

2.3.4 穩(wěn)定性考察 另取上述3個(gè)濃度的JBP 485溶液,制備低、中、高濃度的血漿樣品溶液,放置于以下條件中:室溫放置8 h；經(jīng)過3次凍融循環(huán)(-20～25℃)；-20℃冰箱30 d。分別測定樣品濃度,結(jié)果測得的JBP 485的精密度(RSD)和準(zhǔn)確度(RE)均在± 11%以內(nèi),說明藥物在血漿中較為穩(wěn)定。

2.3.5 回收率考察 照“血漿樣品處理方法”操作,分別在空白血漿沉淀蛋白前后加入低、中、高3種濃度的JBP 485標(biāo)準(zhǔn)溶液,以不參與血漿沉淀蛋白步驟的樣品得到的色譜峰面積為100%。結(jié)果JBP 485在0.25, 2.5,10μg·mL-13個(gè)濃度下的回收率分別為(91.4± 2.5)%,(90.2±6.9)%和(88.1±9.5)%。

2.3.6 給藥方案和樣品采集 健康雄性Wistar大鼠12只,體質(zhì)量約220 g,動物許可證號SCXK(遼)2008-0002,隨機(jī)分成兩組,每組6只,實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食過夜(不禁水),乙醚麻醉后灌胃:①JBP 485水溶液(25 mg·kg-1,對照組)；②JBP 485微乳(16 mg·kg-1,實(shí)驗(yàn)組)。給藥前取空白血,于給藥后第0.08,0.17,0.33,0.5,1,2,4,6,8,10,12,14,24 h大鼠眼眶取血0.3 mL,置于涂有肝素的離心試管中,離心10 min(10 000g·min-1),分離出血漿,置于-20℃冰箱中保存待測。根據(jù)血藥濃度,計(jì)算藥動學(xué)數(shù)據(jù)。

2.4 藥動學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 兩種制劑的血藥濃度-時(shí)間曲線比較 分別采用大鼠單次灌胃JBP 485水溶液和JBP 485微乳的血藥濃度平均值,繪制曲線圖,藥物濃度-時(shí)間曲線見圖4。

2.4.2 藥動學(xué)參數(shù)計(jì)算 使用DAS 2.1.1數(shù)據(jù)庫分別對兩種制劑的大鼠體內(nèi)血藥濃度進(jìn)行處理,求算藥動學(xué)參數(shù)。各主要藥動學(xué)參數(shù)結(jié)果見表1。

3 討論

本課題組已通過大鼠體外小腸吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,JBP 485水溶液的表觀滲透系數(shù)約為5.01× 10-6cm·s-1,提示JBP 485的滲透性可能較低［12］。雖然此藥水溶性好,但是口服生物利用度較低,僅為30%。為了進(jìn)一步改善JBP 485的口服吸收,提高其生物利用度,本實(shí)驗(yàn)以制備方法簡便的W/O型微乳作為載體,制得JBP 485微乳。

圖3 4種血漿樣品的圖譜A.JBP 485的質(zhì)譜圖;B.空白血漿色譜圖;C.大鼠口服微乳后8 h后的血漿樣品色譜圖;D.空白血漿中加入0.10μg·mL-1JBP 485的樣品色譜圖Fig.3 Chromatograms of four kinds of p lasma samp lesA.Product ion mass spectra of JBP 485;B.MRMchromatograms for drug-free plasma;C.plasma sample 8 h after oral adiminstration of 16mg·kg-1JBP 485 in rats;D.plasma spiked with 0.10μg·mL-1of JBP 485

圖4 大鼠灌胃JBP 485水溶液和JBP 485微乳后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

由于JBP 485的親水性強(qiáng),而親脂性較差,在制備微乳的過程中考察了辛癸酸甘油單酯、肉豆蔻酸異丙酯等油相,最終選擇了生物相容性好、容納水相能力相對較高的三油酸甘油酯作為油相,但是當(dāng)藥物水溶液的濃度較高(>40%)時(shí),制備成微乳,放置12 h后,有藥物析出。本研究旨在對JBP 485這類水溶性好的小分子化合物進(jìn)行劑型改造,選擇微乳等劑型,以提高其口服生物利用度為目的進(jìn)行的初步研究,本課題組成員曾以低、中、高劑量JBP 485對大鼠灌胃,進(jìn)行體內(nèi)藥動學(xué)研究。本研究為了實(shí)驗(yàn)的整體性,選擇了其中的中劑量,即25 mg·kg-1作為各種劑型的大鼠體內(nèi)藥動學(xué)研究。由于微乳的載藥量有限,在藥動學(xué)研究中微乳的給藥劑量為16 mg·kg-1,而水溶液為25 mg·kg-1。雖然JBP 485的微乳制劑劑量偏低,但是各時(shí)間點(diǎn)上血藥濃度仍然與口服水溶液后相差不大。今后研究中為了進(jìn)一步提高載藥量,可以考慮采用其他油相與乳化劑。

表1 大鼠分別灌胃JBP 485溶液和微乳后JBP 485的藥動學(xué)參數(shù)Tab.1 Pharmacokinetic parameters of JBP 485 in rats after oral JBP 485 solution and JBP 485-PLGA NPs ±s,n＝6

表1 大鼠分別灌胃JBP 485溶液和微乳后JBP 485的藥動學(xué)參數(shù)Tab.1 Pharmacokinetic parameters of JBP 485 in rats after oral JBP 485 solution and JBP 485-PLGA NPs ±s,n＝6

藥物劑量/ (mg·kg-1) t1/2tmaxh AUC0-t/ (μg·h·L-1) F/ % JBP 85水溶液25 1.5±0.7 1.00±0.00 10.3±2.2…JBP 485微乳16 7.0±1.7 0.35±0.19 12.6±3.2 191.3

本研究通過比較JBP 485微乳與JBP 485水溶液的大鼠體內(nèi)藥動學(xué)情況發(fā)現(xiàn),JBP 485微乳具有促吸收作用的原因可能是:油相將JBP 485水溶液包裹而形成JBP 485微乳,口服微乳制劑的表面張力較低,易通過胃腸道的水化層,與腸道有良好的通透性和親合性,乳滴易于透過腸壁直接被吸收［13］,而JBP 485本身脂溶性較差,JBP 485水溶液直接透過腸壁而被吸收會比較困難；同時(shí)微乳可經(jīng)淋巴吸收,克服了肽類藥物的首關(guān)效應(yīng)。

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DOI 10.3870/yydb.2014.02.001

Preparation and Pharmacokinetics of JBP 485-loaded W/O Microemulsion for Oral Delivery

LI Lei,WANG Chang-yuan,CAI Yun,GAO Peng-cheng,TIAN Yan,LIU Ke-xin
(School of Pharmacy, Dalian Medical University,Dalian 116044,China)

Objective To prepare JBP 485-loaded oral microemulsion,and to study the shape characteristics,in vitrostability,and its pharmacokinetics in rats.MethodsPseudo ternary phase diagramwas adopted to optimize the formula of JBP 485 microemulsion.Drug loading capability,stability and viscosity were used as the indexes for the assessment of the best formula.Rats were used in the study to compare the oral bioavailability of JBP 485 solution and JBP 485 microemulsion.ResultsGlycerol trioleate/ODO-L/EtOH/H2O(Km＝1∶1)was selected as the delivery systemof JBP 485.The prepared JBP 485 microemulsion was stable in thermodynamic assessment.The particle diameter was 60-120 nmand the drug-loading capability was 35μg·mL-1.The relative bioavailability of the prepared JBP 485microemulsion reached 191.3%compared with the JBP 485 solution.ConclusionThe prepared JBP 485 microemulsion is stable,of low toxity,and can prolong the circulation time in vivo and improve the bioavailability.

JBP 485;Microemulsion;Pseudo-ternary phase diagram;Bioavailability;Pharmacokinetics

R944;TQ460.6;R969.1

A

1004-0781(2014)02-0135-05

2012-08-13

2013-06-08

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30672498)

李磊(1976-),女,湖北武漢人,副教授,博士,主要從事藥物新劑型研究。電話:0411-86110420,E-mail：llwht@163.com。

劉克辛,教授,從事研究:藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和藥動學(xué)。電話:0411-86110407,E-mail：kexinliu@dlmedu.edu.cn。