付榮，孫麗，王曉麗，胡士濤，季虹，榮海欽,*

1.濟南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟南250062

2.山東省內(nèi)分泌與代謝病研究所山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，濟南250062

近年來，糖尿病的患病率呈逐年上升的趨勢，合理的防治糖尿病尤為重要。糖尿病是一種以血糖升高、胰島素分泌不足和胰島素抵抗為特征的代謝性疾病[1]。胰島 β細胞的減少是其發(fā)生發(fā)展的核心[2-3]。胰島β細胞的減少通常是由于細胞凋亡，導(dǎo)致胰島β細胞凋亡的一個重要因素是細胞內(nèi)的氧化壓力[4-5]。此外，作為另一種細胞破壞的方式，自噬性細胞死亡也愈來愈為人們所關(guān)注[6]。

目前研究發(fā)現(xiàn)多種重金屬可導(dǎo)致細胞的自噬與凋亡[7]。鉛是一種有害重金屬，由于其廣泛使用已在世界很多地方造成了嚴重的環(huán)境污染和健康問題。鉛可通過多種途徑進入人體，并可對多個系統(tǒng)(包括神經(jīng)、血液、消化、循環(huán)和泌尿系統(tǒng)等)造成傷害[8-9]。研究表明，鉛能夠改變細胞氧化還原狀態(tài)，通過促進胰島β細胞產(chǎn)生活性氧造成氧化壓力，進一步導(dǎo)致胰島β細胞凋亡[10]。但是鉛能否引起胰島細胞自噬，及引起自噬可能的分子機制尚未明確。本實驗通過研究不同濃度的醋酸鉛對胰島β細胞INS-1自噬與凋亡的影響，探討重金屬污染物鉛造成胰島β細胞損傷可能的分子機制，為采取相應(yīng)措施降低胰島β細胞損傷從而為降低2型糖尿病的患病風(fēng)險提供理論依據(jù)。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器:細胞培養(yǎng)箱(SANYO)，酶標儀(BIO-RAD Model 680)，電泳儀/轉(zhuǎn)印電泳槽(BIO-RAD)，熒光顯微鏡(Olympus BX51)。

試劑:RPMI-1640培養(yǎng)基(hyclone)，胎牛血清(hyclone)，醋酸鉛(分析純，天津市化學(xué)試劑一廠)，磺酰羅丹明B(sulforhodamine B,SRB,Sigma)，三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA,Bio Basic)，磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(CW 0100，北京康為世紀公司)，微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)抗體(CST 2775)，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)抗體(CST 9542)，70 kDa磷酸化 S6激酶(phosphorylated 70 kDa S6 kinase,p70 S6)抗體(CST 9202)，磷酸化的 p70 S6(p-p70 S6)抗體(CST 9205)，HRP-山羊抗兔二抗、HRP-山羊抗小鼠二抗(碧云天)，超敏發(fā)光液ECL試劑盒、活性氧檢測試劑盒(北京普利萊技術(shù)有限公司)。

1.2 實驗材料

細胞系:大鼠胰島瘤細胞系(INS-1)購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。將大鼠胰島瘤細胞INS-1培養(yǎng)于含10%的新生胎牛血清、1%青鏈霉素、50 mmoly·L-1β-巰基乙醇的 RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞長至滿度約80%時，用0.25%胰酶進行消化傳代。

1.3 SRB法檢測細胞存活率

將 INS-1細胞以1.5×105個·mL-1接種于96孔板，每組設(shè)6個重復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后分組暴露，設(shè)立醋酸鉛組(醋酸鉛濃度分別為 0.1、1 和 10 μmol·L-1)與正常對照組(加等量培養(yǎng)基)，暴露24和48 h后，吸去培養(yǎng)基，SRB法染色，以檢測波長515 nm測定各孔吸光度(optical density,OD)并計算各組細胞相對存活率(相對存活率=藥物處理組OD值/對照組OD值 ×100%)。

1.4 Western blot法檢測自噬與凋亡標志蛋白的表達

將 INS-1細胞以1.5×106個·mL-1接種于10 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h后分組暴露，設(shè)立醋酸鉛組(醋酸鉛濃度分別為 0.1、1 和 10 μmol·L-1)與正常對照組(加等量培養(yǎng)基)，暴露24和48 h后，提取細胞蛋白，Bradford法測每組蛋白濃度。加上樣緩沖液，制備成蛋白樣品，進行Western blot實驗，檢測各組細胞自噬標志蛋白LC3-II、凋亡標志蛋白PARP的剪切帶(89 kDa)及mTOR信號途徑標志分子p-p70 S6K表達情況，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.5 活性氧檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)ROS水平

將INS-1細胞以1.5×106個·mL-1接種于3.5 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后，設(shè)立醋酸鉛組(醋酸鉛濃度分別為 0.1、1 和 10 μmol·L-1)與正常對照組(加等量培養(yǎng)基)，暴露48 h后，加入檢測探針2',7'-二氯熒光素二乙酸鹽(2',7'-dichlorofluorescin diacetate,DCFHDA)，探針濃度用培養(yǎng)基稀釋至 10 μmol·L-1，置于培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中負載探針1 h;10%PBS洗皿3次，使用倒置熒光顯微鏡以激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm檢測各組熒光強度并拍照。

1.6 NAC預(yù)處理細胞，檢測細胞自噬與凋亡是否受到抑制

將實驗細胞分為對照組、NAC組、NAC+醋酸鉛組和醋酸鉛組，對照組藥物劑量為0，NAC組為只加入400 μmol·L-1的NAC，NAC+醋酸鉛組為先加入400 μmol·L-1的 NAC，1 h 后再加入 10 μmol·L-1醋酸鉛，醋酸鉛組為只加入10 μmol·L-1醋酸鉛。暴露48 h后，SRB法檢測細胞存活率，利用活性氧檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)ROS，Western blot法檢測LC3-II與PARP的剪切帶(89 kDa)水平的變化，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對相關(guān)數(shù)據(jù)進行分析，組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和t檢驗，以p＜0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的標準(在以下各圖表中，*表示:與對照組相比，p＜0.05)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 醋酸鉛對INS-1細胞存活率的影響

與對照組100%細胞存活率相比，醋酸鉛暴露24 h 后，1 和 10 μmol·L-1醋酸鉛組的細胞存活率明顯降低(p ＜0.05)，48 h 后 0.1、1 和 10 μmol·L-1組的細胞存活率均明顯降低(如圖1)。

圖1 不同濃度醋酸鉛對INS-1細胞存活率的影響 (*p＜0.05)Fig.1 The effect of lead acetate on survival rates in INS-1 cells(*p＜0.05)

2.2 醋酸鉛對INS-1細胞LC3-II、PARP的切割帶(89 kDa)及p-p70 S6K表達的影響

與對照組相比，1 和 10 μmol·L-1醋酸鉛暴露組自噬標志蛋白LC3-II及凋亡標志蛋白PARP的剪切帶表達均有所增加，且增加呈時間-劑量依賴性(如圖2)。而mTOR信號途徑標志分子p-p70 S6K表達卻無明顯變化(如圖3)。

2.3 醋酸鉛暴露后INS-1細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平

與對照組相比，以 0.1、1 和 10 μmol·L-1醋酸鉛暴露INS-1細胞48 h后，INS-1細胞內(nèi)有活性氧產(chǎn)生，且呈劑量依賴性(如圖4)。

2.4 NAC處理后INS-1細胞自噬和凋亡情況

與對照組相比，NAC+醋酸鉛組和醋酸鉛組OD值均減低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(各組OD值分別為0.831±0.047、0.811±0.058、0.543±0.056和 0.287±0.028，p＜0.05)，NAC+醋酸鉛組存活率明顯高于醋酸鉛組(p ＜0.05)(如圖 5)，細胞內(nèi) ROS 減少(如圖 6)，且LC3-II和 89 kDa的 PARP剪切帶表達均減少(如圖 7)。

3 討論(Discussion)

圖2 醋酸鉛對INS-1細胞LC3-Ⅱ和PARP的剪切產(chǎn)物表達的影響Fig.2 Effects of lead acetate on LC3-Ⅱand cleaved PARP in INS-1 cells

圖3 醋酸鉛對INS-1細胞p-p70 S6K表達的影響Fig.3 Effects of lead acetate on p-p70 S6K in INS-1 cells

圖4 醋酸鉛對 INS-1 細胞內(nèi) ROS 水平的影響(A:對照、B:0.1 μmol·L-1、C:1 μmol·L-1、D:10 μmol·L-1)(×100)Fig.4 Effects of lead acetate on intracellular ROS in INS-1 cells(A:control,B:0.1 μmo·lL-1,C:1 μmo·lL-1,D:10 μmo·lL-1)(×100)

圖5 NAC對醋酸鉛暴露的INS-1細胞存活率的影響(*p＜0.05)Fig.5 Effects of NAC on survival rates in lead acetate exposed INS-1 cells(*p＜0.05)

圖6 NAC對醋酸鉛暴露的INS-1細胞內(nèi)ROS的影響(A:對照、B:NAC、C:NAC+醋酸鉛、D:醋酸鉛)(×100)Fig.6 Effects of NAC on intracellular ROS in lead acetate exposed INS-1 cells(A:control;B:NAC;C:NAC+lead acetate;D:lead acetate)(×100)

圖7 NAC對醋酸鉛暴露的INS-1細胞LC3-Ⅱ和PARP的剪切產(chǎn)物表達的影響Fig.7 Effects of NAC on LC3-Ⅱand cleaved PARP in lead acetate exposed INS-1 cells

胰島素是人體內(nèi)最主要的降糖激素，所以胰島β細胞作為人體內(nèi)產(chǎn)生胰島素的細胞在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。減少胰島β細胞的破壞，維持胰島β細胞的功能對于糖尿病的防治具有重要意義。胰島β細胞的減少是由多種原因引起的細胞死亡，細胞死亡主要包括3種類型:細胞壞死、細胞凋亡和自噬性細胞死亡[11]。正常狀態(tài)下，自噬性細胞死亡是細胞通過產(chǎn)生自噬體以“自身消化”的方式來調(diào)控細胞內(nèi)衰老蛋白的循環(huán)，清除受損的細胞器，保護饑餓狀態(tài)下的細胞，所以自噬對于維持細胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用。然而，自噬也可引起細胞通過非細胞凋亡方式死亡，自噬異常還可導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生，如癌癥、神經(jīng)變性性疾病、肝性腦病等，目前一些研究還發(fā)現(xiàn)了其對糖尿病具有潛在作用[12]。本實驗利用不同濃度的醋酸鉛暴露胰島β細胞INS-1，來觀察重金屬鉛對胰島β細胞自噬與凋亡的作用。

3.1 醋酸鉛對INS-1細胞存活率的影響

在本實驗中，SRB實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，0.1 μmol·L-1醋酸鉛暴露組的細胞存活率在處理時間為24 h時與對照組沒有明顯差異，考慮可能與0.1 μmol·L-1醋酸鉛濃度較低或24 h作用時間較短，不足以誘導(dǎo)細胞的自噬和凋亡，引起細胞存活率的降低;也可能與醋酸鉛既誘導(dǎo)了細胞保護性的自噬，又誘導(dǎo)了細胞的凋亡有關(guān)。細胞存活率為兩者共同作用的結(jié)果，而0.1 μmol·L-1醋酸鉛組暴露細胞24 h時兩者作用相抵，表現(xiàn)為細胞存活率與對照組沒有明顯差異，但自噬在何種條件下可保護細胞免于發(fā)生凋亡，何種條件下可促使細胞向凋亡轉(zhuǎn)化，從而促進細胞的死亡，還需進一步的實驗證實。

3.2 醋酸鉛對INS-1細胞自噬與凋亡的影響

為了觀察細胞是否發(fā)生了自噬和凋亡，本實驗分別選用了自噬和凋亡的標志蛋白 LC3-Ⅱ和PARP，通過Western blot法檢測其表達情況。細胞中LC3-Ⅱ的表達情況與細胞中自噬體的數(shù)量直接相關(guān)，故可反應(yīng)自噬的活性[13]。作為細胞凋亡的標志分子，PARP與DNA末端結(jié)合而被激活，隨后被剪切為包含89 kDa的片段，該剪切帶可防止細胞內(nèi)能量的耗盡，并參與細胞凋亡的后續(xù)階段[14]。自噬的分子途徑可根據(jù)mTOR分子是否參與分為兩種:mTOR-依賴途徑和mTOR-非依賴途徑。mTOR為自噬調(diào)節(jié)的核心因子，被激活后可使其底物p70 S6K磷酸化為p-p70 S6K[15]。故根據(jù)p-p70 S6K表達情況可推測醋酸鉛誘導(dǎo)的INS-1細胞自噬的可能途徑。本實驗中，隨著作用時間和醋酸鉛濃度的增加，LC3-II及PARP的剪切帶表達均有所增加，說明醋酸鉛可誘導(dǎo)INS-1細胞的自噬和凋亡，且自噬和凋亡水平的增加呈時間-劑量依賴性。但是p-p70 S6K的表達沒有明顯差異，推測醋酸鉛誘導(dǎo)的細胞自噬可能是通過mTOR-非依賴途徑。

3.3 醋酸鉛誘導(dǎo)INS-1細胞自噬與凋亡的可能機制

鉛作為一種應(yīng)用廣泛的重金屬，其毒性及機制也早已被人們熟知，Willis[16]在1965年首先報道了鉛可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，后來許多研究也證實了這一結(jié)論[17-18]。鉛能夠改變細胞的氧化還原狀態(tài)，通過促進胰島β細胞產(chǎn)生活性氧造成氧化壓力，導(dǎo)致胰島β細胞的凋亡。本實驗中也觀察到醋酸鉛暴露的INS-1細胞內(nèi)有活性氧產(chǎn)生，且呈劑量依賴性。NAC是一種廣譜型抗氧化劑，通過促進谷胱甘肽(GSH)的合成來維持細胞GSH水平，清除自由基。因其對細胞毒性小，副作用少，因此被用來緩解各種條件導(dǎo)致的氧化應(yīng)激[19]。本試驗中NAC+醋酸鉛組細胞存活率明顯高于醋酸鉛組，NAC+醋酸鉛組與醋酸鉛組相比LC3-II和89 kDa的PARP切割帶表達均明顯減少，即ROS的清除減少了醋酸鉛誘導(dǎo)的細胞自噬和凋亡。其原因可能是NAC通過增加GSH合成和增強谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)活性來減輕醋酸鉛引起的氧化損傷，這說明ROS參與醋酸鉛誘導(dǎo)的INS-1細胞自噬和凋亡。

綜上所述，我們認為醋酸鉛可能是通過刺激細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生而誘導(dǎo)INS-1細胞自噬與凋亡，醋酸鉛誘導(dǎo)的INS-1細胞自噬可能是通過mTOR-非依賴途徑。本課題利用胰島瘤細胞作為模式細胞研究鉛對胰島細胞自噬和凋亡的影響，瘤細胞與正常細胞生長特點和功能可能有所差異，因此，醋酸鉛對腫瘤細胞與對正常細胞自噬和凋亡過程的影響可能有區(qū)別。醋酸鉛誘導(dǎo)自噬具體的分子通路、自噬與凋亡之間的關(guān)系等問題也尚不明確，還需要進一步的實驗進行研究，為下一步采取相應(yīng)措施降低胰島β細胞損傷從而降低2型糖尿病的患病風(fēng)險提供更加可靠的依據(jù)。

致謝:感謝中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心章大鵬老師的幫助與支持。

[1]Lorenzo C,Rewers M J,Wagenknecht L E,et al.Insulin resistance,β-cell dysfunction,and conversion to type 2 diabetes in a multiethnic population,the insulin resistance atherosclerosis study[J].Diabetes Care,2010,33(1):67－72

[2]Defronzo R A,Abdul-Ghani M A.Preservation of β-cell function:The key to diabetes prevention[J].Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism,2011,96(8):2354－2366

[3]Kahn S E.Clinical review 135:The importance of β-cell failure in the development and progression of type 2 diabetes[J].Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism,2001,86(9):4047－4058

[4]Henriksen Erik J,Diamond-Stanic Maggie K,Marchionne Elizabeth M.Oxidative stress and the etiology of insulin resistance and type 2 diabetes[J].Free Radical Biology&Medicine,2011,51(5):993－999

[5]Robertson R P,Harmon J S.Diabetes,glucose toxicity,and oxidative stress:A case of double jeopardy for the pancreatic islet β cell[J].Free Radical Biology&Medicine,2006,41(2):177－184

[6]Marchetti P,Masini M.Autophagy and the pancreatic beta-cell in human type 2 diabetes[J].Autophagy,2009,5(7):1055－1056

[7]Chen YW,Ching YY,Chun F H,et al.Heavy metals,islet function and diabetes development[J].Islets,2009,1(3):169－176

[8]Flora G,Gupta D,Tiwari A.Toxicity of lead:A review with recent updates[J].Interdisciplinary Toxicology,2012,5(2):47－58

[9]Gillis B S,Arbieva Z,Gavin L M.Analysis of lead toxicity in human cells[J].BMC Genomics,2012,13:344

[10]Afridi H I,Kazi T G,Kazi N,et al.Evaluation of status of toxic metals in biological samples of diabetes mellitus patients[J].Diabetes Research and Clinical Practice,2008,80(2):280－288

[11]Lockshin R A,Zakeri Z.Apoptosis,autophagy,and more[J].International Journal of Biochemistry&Cell Biology,2004,36(12):2405－2419

[12]Masini M,Lupi R,Bugliani M,et al.A role for autophagy in beta cell life and death[J].Islets,2009,1(2):157－159

[13]Kuma A,Matsui M,Mizushima M.LC3,an autophagosome marker,can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy:Caution in the interpretation of LC3 localization[J].Autophagy,2007,3(4):323－328

[14]Boulares A H,Yakovlev A G,Ivanova V,et al.Role of poly(ADP ribose)polymerase(PARP)cleavage in apoptosis:Caspase 3 resistant PARP mutant increases rates of apoptosis in transfected cells[J].Journal of Biological Chemistry,1999,274(33):22932－22940

[15]Jung C H,Ro S H,Cao J,et al.mTOR regulation of autophagy[J].Federation of European Biochemical Societies Letters,2010,584(7):1287－1295

[16]Wills E D.Mechanisms of lipid peroxide formation in tissues.Role of metals and haematin proteins in the catalysis of the oxidation unsaturated fatty acids[J].Biochimica et Biophysica Acta,1965,98:238－251

[17]Rehman U S.Lead induced regional lipid peroxidation in brain[J].Toxicology Letters,1984,21(3):333－337

[18]Somashekaraiah B V,Padmaja K,Prasad A R.Effect of lead on lipid peroxidation of the hepatic subcellular organelles of developing chick embryos[J].Biochemistry International,1992,27(5):803－809

[19]Gurer H,Ercal N.Can antioxidants be beneficial in the treatment of lead poisoning[J].Free Radical Biology&Medicine,2000,29(10):927－945