賴金龍,陶宗婭,*,吳國,付倩,張紅,羅學(xué)剛

1.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,成都610101

2.生物質(zhì)材料教育部工程研究中心西南科技大學(xué),綿陽621010

鄰苯二甲酸二丁酯(di-n-butyl phthalate,DBP)作為增塑劑和軟化劑廣泛用于塑料制品的生產(chǎn)加工,其用量通常為30% ～40%[1]。塑料制品在使用、廢棄及焚燒過程中,DBP可逐漸游離出來進(jìn)入環(huán)境,已呈現(xiàn)明顯的環(huán)境累積效應(yīng),成為農(nóng)耕土壤中最常被檢出的有機(jī)污染物之一[2]。DBP也可通過呼吸、飲水、食物、化妝品接觸等途徑進(jìn)入人體,對人體健康構(gòu)成潛在的危害[3-4],已被多個國家列為重點(diǎn)控制的環(huán)境有毒污染物[5]。

張金紅等[6]進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,DBP通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,具有抑制人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞和人早幼粒白血病細(xì)胞增殖的正效應(yīng)。DBP對活體動物的急性毒理等級較低,對魚[7-8]、鼠[9]等實(shí)驗(yàn)動物主要表現(xiàn)為生長、生殖系統(tǒng)、胚胎發(fā)育等不可逆轉(zhuǎn)的損傷。DBP對多種水生藻類具有生態(tài)毒性[10-12]。進(jìn)入植物體內(nèi)的DBP通過根系分泌物進(jìn)入土壤并產(chǎn)生明顯的化感作用[13-15],影響植物形態(tài)分化[16],損傷細(xì)胞器[17],干擾正常生理代謝及降低產(chǎn)量和品質(zhì)[18]。DBP對苦草[19]、擬南芥幼苗[20]產(chǎn)生明顯的氧化損傷,顯著降低苦草植株的氨基酸和蛋白質(zhì)總量及谷胱甘肽含量,也顯著抑制菠菜和豌豆幼苗生長[21]。

關(guān)于DBP環(huán)境生物學(xué)效應(yīng)的多數(shù)研究分別從植物營養(yǎng)代謝、過氧化代謝、生態(tài)毒性等方面積累了一定的研究成果,但DBP對植物細(xì)胞微核形成的影響及毒理機(jī)制的研究鮮有報道。本文選用對環(huán)境誘變物較為敏感的蠶豆為試材,通過觀察、測試分析蠶豆根尖細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)和抗氧化酶活性等變化,探討DBP暴露對蠶豆的致毒效應(yīng),為農(nóng)用地膜的環(huán)境安全性評估提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試材及其處理

蠶豆品種為西昌大白胡豆(Vicia faba L.),購自四川省金種燎原種業(yè)科技有限責(zé)任公司。根據(jù)本研究室近3年盆栽作物模擬實(shí)驗(yàn)的農(nóng)用地膜用量(每盆0.42～42 g)[22],以地膜中DBP用量為30%計算,則DBP在盆栽土壤中的添加量含量為每盆0.45～45 mmol(每盆裝土16 kg);再結(jié)合已進(jìn)行的溶液培養(yǎng)植物試材的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本文設(shè)計DBP處理溶液的濃度(ρ)分別為 9 mmol·L-1(T1)、18 mmol·L-1(T2)、27 mmol·L-1(T3)和36 mmol·L-1(T4)。配制 DBP溶液時加入少量吐溫-80助溶。

選擇飽滿的蠶豆,用蒸餾水漂洗2次,用0.5%KM-nO4浸泡10 min,洗凈后用蒸餾水浸種24 h后,置25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。選擇胚根長度一致的蠶豆放入培養(yǎng)皿(直徑9 cm),每皿10粒,分組編號,每組分別加入DBP處理液10 mL,作為處理組;以含少量吐溫-80的水溶液處理作為對照組(CK)。培養(yǎng)皿置25℃、光/暗比為12 h/12 h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后,一部分蠶豆胚根用于測定抗氧化酶活性等,均為3次重復(fù);另一部分蠶豆用蒸餾水浸洗3次,再置于濕紗布中恢復(fù)培養(yǎng)24 h,取其根尖用于細(xì)胞微核觀測。

1.2 測試方法

蠶豆微核觀測及統(tǒng)計參照陶少武的方法[23],每一處理選取5個根尖,每個根尖觀察1 000個細(xì)胞。SOD活性(U·min-1·g-1FW)測定采用氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)法,酶活力單位(U)定義為將NBT還原抑制為對照一半(50%)時所需的酶量。POD活性(U·s-1·g-1FW)測定采用愈創(chuàng)木酚法,以470 nm處吸光度值(A470)變化0.01定義為1個酶活力單位。CAT活性(U·s-1·g-1FW)測定采用紫外吸收法,以 A240變化 0.001定義為1個酶活力單位。觀察、測試和分析均重復(fù)3次。用DPS7.05進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析,用Excel 2003作圖。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 DBP對蠶豆胚根生長的影響

圖1 不同濃度DBP對蠶豆幼根生長速率的影響注:“*”表示與對照比較的差異顯著性(p＜0.05),下同。Fig.1 Effects of different concentration of DBP on root growth rates in broad beanNotes:“* ”indicating that there were significant difference compared with CK(p＜0.05).The same as below.

圖1可見,正常條件下蠶豆胚根生長速率表現(xiàn)為48 h＞24 h＞72 h,即48 h時胚根快速伸長,72 h時降至0.10～0.16 cm·d-1,生長緩慢。處理組幼根生長速率不同程度被抑制,其中48 h時T1～T4處理均顯著低于CK(p＜0.05)。胚根還表現(xiàn)出根加粗、褐化、彎曲生長、根尖壞死等受害癥狀。

2.2 DBP暴露對蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂的影響及微核效應(yīng)

2.2.1 細(xì)胞有絲分裂指數(shù)

圖2 DBP對蠶豆根尖有絲分裂各時期細(xì)胞比例和有絲分裂指數(shù)的影響注:有絲分裂指數(shù)(MI)為各時期分裂細(xì)胞比例之和;"*"表示相同處理時間、同一分裂時期，各處理與對照比較的差異顯著性(p＜0.05);Fig.2 Effects of DBP on the ratio of mitotic phase and mitotic index in root tip cells of broad bean.Notes:Mitotic index(MI)was equivalent to the sum of ratio of mitotic phase."*"Indicates that the treatments were significant difference compared with CK in the same treatment time and division phase(p＜0.05).

重金屬[24]、農(nóng)藥殘留等[25]土壤污染物進(jìn)入植物體后一部分積累在根部,嚴(yán)重抑制根系生長,直接或間接作用于DNA分子從而引起DNA分子損傷,進(jìn)一步影響細(xì)胞分裂、誘發(fā)染色體畸變。萌發(fā)蠶豆用DBP處理后,分別觀察根尖分裂細(xì)胞前期、中期、后期、末期細(xì)胞所占的比例。統(tǒng)計結(jié)果顯示(圖2),24 h時隨著DBP濃度增加,進(jìn)行有絲分裂的細(xì)胞數(shù)逐漸降低,T3～T4處理各相分裂細(xì)胞數(shù)均顯著低于CK(p＜0.05);48 h～72 h時處于有絲分裂前期的細(xì)胞數(shù)逐漸增加,T2～T3處理已顯著高于CK(p＜0.05),且明顯高于中期、后期和末期的細(xì)胞數(shù),表明分裂細(xì)胞被阻斷在有絲分裂前期的比例增加,改變了細(xì)胞正常的有絲分裂進(jìn)程。統(tǒng)計有絲分裂指數(shù)(mitotic index,MI)亦顯示,24 h時MI值隨DBP濃度增加而顯著降低(p＜0.05),表明DBP對蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂的影響主要體現(xiàn)在暴露初期,這一結(jié)果與細(xì)胞有絲分裂各時期比例的變化具有一致性。

2.2.2 細(xì)胞微核及染色體畸變

DBP暴露誘導(dǎo)蠶豆根尖細(xì)胞微核和染色體結(jié)構(gòu)畸變(圖3)。處理24 h時,觀察到細(xì)胞分裂前期時的單微核(圖3A)和染色體滯后或丟失(圖3B);微核率(MCN)隨DBP濃度增加呈“先升后降”的變化趨勢(表1),均顯著高于 CK(p ＜0.05),ρ(DBP)27 mmol·L-1(T3)時達(dá)最大值,這與常青等[26]的研究結(jié)果具有一致性。處理48 h時,觀察到處于分裂末期的較多細(xì)胞出現(xiàn)不同類型的染色體橋,如單橋(圖3C)、雙橋和多橋等及染色體的非整倍性分裂,如兩個子細(xì)胞分別含12條(圖3D上)和10條染色體(圖3D下);72 h 時,ρ(DBP)9 ～18 mmol·L-1(T1、T2)時便可觀測到紡錘體多極分裂(圖3E)和染色體斷片(圖3F),表明DBP暴露誘發(fā)蠶豆根尖細(xì)胞出現(xiàn)明顯的染色體結(jié)構(gòu)異常。

圖3 DBP對蠶豆根尖細(xì)胞微核及染色體畸變的影響注:A.前期微核;B.末期染色體滯后或丟失;C.末期染色體橋;D.染色體非整倍性;E.紡錘體多極分裂;F，染色體斷片F(xiàn)ig.3 The formation of micronucleus and chromosome aberration in root tip cells of broad bean treated with DBPNotes:A.Micronucleus in mitotic prophase,B.Chromasome lag and loss in mitotic telophase,C.Chromosome bridge in mitotic telophase,D.Chromosome aneuploidy,E.Multipolar mitosis spindle,F.Chromosome fragments

表1 不同濃度DBP對蠶豆根尖細(xì)胞微核率的影響Table 1 Effects of DBP concentration on micronucleus rate in root tip cells of broad bean

2.3 胚根抗氧化酶活性對DBP的響應(yīng)

SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)最主要的抗氧化酶,其活性變化能夠反映植物逆境條件下抵御過氧化傷害的能力。與CK比較,處理組胚根SOD活性大都有所提高(圖4),其中T2、T3在各處理時段顯著增加5.41% ～29.68%(p＜0.05)。處理組POD活性變化總體上隨時間延長逐漸上升,但隨DBP濃度增加而遞減(圖5),與CK比較,處理組POD活性在24 h時顯著降低36.27% ～51.32%(p＜0.05),48h時顯著降低20.38% ～34.97%(p＜0.05),72 h時T2～T4顯著降低8.46% ～13.94%(p＜0.05)。CAT活性均顯著低于CK約14.00% ～43.08%(p＜0.05)(圖6)。結(jié)果表明,DBP暴露下蠶豆胚根SOD活性對保護(hù)細(xì)胞膜可能具有重要作用,POD和CAT均表現(xiàn)出不同程度的敏感性。

圖4 不同濃度DBP對蠶豆SOD活性的影響Fig.4 Effects of DBP concentration on SOD activities in broad bean

圖5 不同濃度DBP對蠶豆POD活性的影響Fig.5 Effects of DBP with different concentration on POD activities in broad bean

圖6 不同濃度DBP對蠶豆CAT活性的影響Fig.6 Effects of DBP concentration on CAT activities in broad bean

3 討論(Discussion)

鄰苯二甲酸二丁酯是人工合成的有機(jī)化合物鄰苯二甲酸酯類(phthalic acid esters PAEs,即酞酸酯類)中分子量相對較低的一種,主要用于塑料、乳膠粘合劑、化妝品及染料溶劑等。在塑料制品加工過程中,DBP及其同系物與聚烯烴分子主要由氫鍵或范德華力聯(lián)接,并沒有聚合到塑料的高分子碳鏈上,兩者保留著各自相對獨(dú)立的化學(xué)性質(zhì)[27]。因此,DBP很容易被釋放出來,對大氣、水體、土壤、生物體構(gòu)成潛在的危害[28]。

微核是獨(dú)立于主核的微小核,染色略淺,直徑小于主核的1/3,來源于丟失的整條染色體、染色體斷片和單條或多條滯后的染色體[29]。植物細(xì)胞內(nèi)微核的形成主要通過以下幾種途徑,一是在非整倍性斷裂誘變劑(如秋水仙素)處理下,紡錘絲結(jié)構(gòu)被損傷,在細(xì)胞分裂后期染色體無法被納入子細(xì)胞核,形成微核;二是環(huán)境誘變劑進(jìn)入細(xì)胞,破壞DNA結(jié)構(gòu)形成DNA分子斷片,該斷片因未與紡錘絲相連,無法隨染色體的正常分離被拉向兩極,因而隨機(jī)滯留在某一個子細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中形成獨(dú)立于細(xì)胞核的微核[30];三是環(huán)境誘變劑導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧損傷DNA和其他一些細(xì)胞大分子,形成染色體斷片,最終形成微核[31]。Chang Qing等[32]研究表明,DBP同系物鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)是一種環(huán)境致突變劑,可誘發(fā)高微核率的發(fā)生、染色體畸變以及DNA多態(tài)性,表明DEHP對植物具有明顯的遺傳損傷。本文結(jié)果顯示,DBP暴露可誘導(dǎo)蠶豆根尖細(xì)胞微核率顯著高于CK約3～5倍,具有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系,表明DBP也是一種環(huán)境致突變劑。

綠色需氧植物產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS)的主要途徑有葉綠體光合電子傳遞鏈、線粒體電子傳遞鏈和細(xì)胞膜上的氧化還原反應(yīng)。在多種脅迫因素下生物體的生長發(fā)育異常與活性氧ROS代謝密切相關(guān),SOD、POD和CAT是細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的抗氧化酶。本文表明,萌發(fā)蠶豆用ρ(DBP)9～36 mmol·L-1處理,能夠誘導(dǎo)SOD催化活性增強(qiáng),這對于緩解超氧陰離子自由基(O-2·)的過氧化傷害有積極意義,而POD與CAT活性均受到顯著抑制,導(dǎo)致清除ROS的效率降低[12]。

綜上所述,DBP作為環(huán)境致突變劑,具有染色體非整倍性斷裂誘變劑的作用,可破壞紡錘絲結(jié)構(gòu),導(dǎo)致紡錘體多極分裂形成染色體的非整倍性及染色體丟失或滯后,是微核形成的主要原因。而未被及時清除的過量ROS亦可作用于DNA分子而導(dǎo)致形成部分染色體斷片,也是微核形成的原因之一。

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