于彩虹，周珂，2，劉蕓 ，劉暢，羅京，于廣飛

1.中國(guó)礦業(yè)大學(xué)(北京)，北京100083

2.環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所環(huán)境與健康實(shí)驗(yàn)室，廣州510655

我國(guó)現(xiàn)有城鎮(zhèn)污水處理廠多采用A2/O(厭氧-缺氧-好氧法)工藝，具有較好的脫氮除磷的效果，以處理后化學(xué)需氧量(COD)、生化需氧量(BOD)等常規(guī)指標(biāo)的達(dá)標(biāo)為目的。然而我國(guó)城鎮(zhèn)污水處理廠進(jìn)水組份異常復(fù)雜，含多種工業(yè)廢水和生活污水，其中含有大量合成有毒有機(jī)物，一般難以被微生物所降解或完全去除，盡管這些污染物在水中濃度低，但毒性危害大，有的還具有致癌、致畸和至突變特性［1］。

針對(duì)現(xiàn)有排放指標(biāo)局限于理化指標(biāo)，不足以滿足污水處理廠出水水質(zhì)毒性風(fēng)險(xiǎn)控制的情況，近年來，國(guó)內(nèi)許多研究者認(rèn)識(shí)到利用活體動(dòng)物開展排水毒性測(cè)試對(duì)保護(hù)環(huán)境、改善水處理工藝的重要性，相關(guān)的研究工作正在逐年增加。其中生物毒性測(cè)試方法集中在不同生物包括魚類、蚤類、發(fā)光菌等的急性毒性測(cè)試方面［2-5］，但急性毒性效應(yīng)只能反映廢水毒性的一個(gè)方面。因此，對(duì)城鎮(zhèn)污水處理廠進(jìn)出水的慢性毒性效應(yīng)進(jìn)行探索顯得非常必要。

魚類早期生命階段被廣泛地運(yùn)用于胚胎發(fā)育基因表達(dá)控制的研究，后被用于化合物的急慢性毒性檢測(cè)以及重金屬的生物累積效應(yīng)的研究等［6］。針對(duì)排水生物毒性測(cè)試，EPA推薦使用3種以上生物種和急、慢性毒性的測(cè)試方法，觀察指標(biāo)包括胚胎損傷、畸形、生長(zhǎng)和死亡等［7］。日本青鳉作為亞洲地區(qū)廣泛使用的國(guó)際通用毒理生物物種，其早期生命階段慢性毒性暴露實(shí)驗(yàn)已經(jīng)在工業(yè)廢水［10］中得到應(yīng)用。

本文選用日本青鳉早期生命階段暴露實(shí)驗(yàn)，測(cè)試了廣州地區(qū)三家城鎮(zhèn)污水處理廠的進(jìn)出水急慢性毒性效應(yīng)情況，為全面評(píng)價(jià)污水處理廠出水毒性風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 樣品采集

樣品采集瓶采用棕色帶塞細(xì)口玻璃瓶，樣品瓶經(jīng)重鉻酸鉀洗液潤(rùn)洗浸泡過夜，用自來水、蒸餾水洗凈后倒置晾干待用。采集的樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后立即處于4℃下保存，不添加任何溶劑及藥品，試驗(yàn)前取出，使其自然升溫至室溫(空調(diào)控制室溫在26℃)后使用。

實(shí)驗(yàn)需要的器具包括:200 mL結(jié)晶皿，500 mL燒杯，100 mL和500 mL量筒，1 000 mL容量瓶，溫度計(jì)等。生物顯微鏡(BK5000，重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司)，便攜式多參數(shù)測(cè)定儀(H1-SensionTM156，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)。本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

水樣于2012年8月采集于廣州地區(qū)3家城鎮(zhèn)污水處理廠，3家污水處理廠均采用A2/O的水處理工藝。1和2號(hào)污水處理廠的污水均來自各自周圍居民的生活污水，3號(hào)污水廠的污水來自周圍居民的生活污水以及周邊的印染廠廢水，水樣的常規(guī)水質(zhì)參數(shù)見表1。1，2，3號(hào)污水處理廠的污水日處理量分別為 101.16，5.61，52.81 萬(wàn)立方米。

表1 水樣的常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)Table 1 General water quality parameters of water sample

1.2 試驗(yàn)生物的培養(yǎng)

d-rR品系日本青鏘(Oryzias latipes)來自中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，已經(jīng)在本實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)小規(guī)模繁殖和養(yǎng)殖。性成熟青鳉魚以雌雄比3:2養(yǎng)殖在循環(huán)水系統(tǒng)中，每個(gè)魚缸養(yǎng)殖水約18 L，養(yǎng)殖25條青鳉魚。養(yǎng)殖和試驗(yàn)的溫度控制在25℃左右，光照比為12 h:12 h(白天:黑夜)。每天早晨收取魚卵，用手將魚卵輕輕分離，挑選好的受精卵，用孵化液孵化。親本和小魚均用新孵化的豐年蟲喂養(yǎng)，每天投喂兩次。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 青鳉魚急性毒性測(cè)試

急性毒性測(cè)試參照美國(guó)環(huán)境保護(hù)局制定的魚類急性毒性標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法［8］。試驗(yàn)用魚為孵化30 d左右的幼魚(體重和體長(zhǎng)分別為25.90±1.43 mg和18.95 ±1.21 mm)，試驗(yàn)在 500 mL 的燒杯中進(jìn)行，每只燒杯400 mL試驗(yàn)液，10條幼魚。每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)平行。試驗(yàn)周期為96 h，試驗(yàn)期間不喂食，毎24 h更換1次測(cè)試液并記錄魚的死亡情況，及時(shí)清除死魚?？瞻讓?duì)照采用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水［9］。

1.3.2 青鳉魚胚胎亞慢性毒性測(cè)試

胚胎和幼魚短期慢性毒性測(cè)試方法參照查金苗［10］的方法并加以適當(dāng)修改。根據(jù)急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果來設(shè)計(jì)亞慢性毒性試驗(yàn)測(cè)試液的稀釋梯度。由于急性毒性實(shí)驗(yàn)中測(cè)試液均未表現(xiàn)出急性毒性效應(yīng)，所以亞慢性實(shí)驗(yàn)中出水沒有稀釋，將進(jìn)水設(shè)置為1%、10%和100%3個(gè)梯度。試驗(yàn)采用24孔板作為孵化容器，毎孔一卵，測(cè)試液2 mL，可以有效避免染菌卵對(duì)其它卵的感染。每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行12顆卵，使用胚胎孵化液作為空白對(duì)照。毎24 h更換一次測(cè)試液并在生物顯微鏡下觀察受精卵的胚胎發(fā)育進(jìn)程，記錄發(fā)育過程中一些具有代表性的毒理學(xué)終點(diǎn)，并對(duì)正常以及畸形發(fā)育的魚卵進(jìn)行拍照。記錄胚胎的死亡情況。記錄孵化時(shí)間，統(tǒng)計(jì)14 d胚胎孵化率和畸形率，未孵化的魚卵記為死亡。幼魚孵出后轉(zhuǎn)移至裝有100 mL測(cè)試液的200 mL結(jié)晶皿中，延長(zhǎng)7 d魚苗暴露，并在第1只魚苗孵化2 d后開始投喂豐年蟲，毎24 h更換一次測(cè)試液并觀察魚的存活情況，及時(shí)撈出死魚。最后統(tǒng)計(jì)魚苗存活率。整個(gè)測(cè)試過程為21 d。

1.4 毒性測(cè)試方法質(zhì)量控制

急性毒性測(cè)試中對(duì)照組魚的死亡率低于10%，實(shí)驗(yàn)負(fù)荷不低于0.8 g魚·L-1水，pH波動(dòng)范圍低于0.2。早期慢性毒性測(cè)試中對(duì)照組胚胎孵化率需達(dá)到80%以上，孵化成功后對(duì)照組魚苗存活率不低于80%。整個(gè)試驗(yàn)過程溫度波動(dòng)范圍不超過1℃，測(cè)試液中溶解氧不低于空氣飽和值的60%。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

急性毒性測(cè)試數(shù)據(jù)的處理方法采用點(diǎn)估計(jì)法，如試驗(yàn)中有3個(gè)及以上的濃度梯度產(chǎn)生效應(yīng)即采用概率法計(jì)算LC50值。試驗(yàn)組的毒性數(shù)據(jù)與對(duì)照組對(duì)比，采用SPSS V17.0軟件進(jìn)行樣本檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，p＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 急性毒性結(jié)果

青鳉幼魚急性毒性試驗(yàn)結(jié)果為所有實(shí)驗(yàn)組均沒有出現(xiàn)幼魚死亡現(xiàn)象，即所有水樣對(duì)青鳉幼魚均未產(chǎn)生急性毒性效應(yīng)。

質(zhì)控試驗(yàn)結(jié)果得出青鳉幼魚的重鉻酸鉀24h-LC50為 235.48 mg·L-1，95% 的置信區(qū)間為［223.71，247.25］，國(guó)家環(huán)保總局［11］規(guī)定重鉻酸鉀對(duì)斑馬魚的24h-LC50在200.00 ～400.00 mg·L-1的范圍內(nèi)，才可作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試生物進(jìn)行毒性測(cè)試試驗(yàn)。由此，本實(shí)驗(yàn)室青鳉幼魚亦可作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試生物對(duì)污水處理廠進(jìn)出水進(jìn)行毒性測(cè)試。

2.2 慢性毒性結(jié)果

2.2.1 胚胎毒性

1、3號(hào)污水處理廠的進(jìn)水原液和出水及2號(hào)污水處理廠的進(jìn)水原液對(duì)青鳉胚胎及幼魚暴露后，胚胎孵化率與對(duì)照組均產(chǎn)生顯著性差異(p＜0.05)。各水樣對(duì)胚胎和幼魚產(chǎn)生的各種慢性毒性效應(yīng)見表2。

由表2試驗(yàn)結(jié)果可以看出:3個(gè)進(jìn)水的1%和10%試驗(yàn)組對(duì)青鳉魚胚胎孵化率、孵化時(shí)間、魚苗畸形率和魚苗死亡率與對(duì)照組相比均未產(chǎn)生顯著差異(p＞0.05)。各水樣對(duì)青鳉魚胚胎的孵化時(shí)間沒有影響，暴露組和對(duì)照組孵化時(shí)間均在9 d左右。3個(gè)污水廠進(jìn)水和出水中，除了2號(hào)廠出水的胚胎孵化率以及3號(hào)廠出水的魚苗畸形率與各自對(duì)照無(wú)顯著差異外，其余進(jìn)出水在胚胎孵化率、魚苗畸形率效應(yīng)中均產(chǎn)生顯著差異(p＜0.05)。其中3個(gè)廠進(jìn)水的魚苗畸形率分別為(24.60±6.87)%、(19.91±6.56)%、(33.73 ±8.94)%。孵化期間，使用生物顯微鏡可以觀察到胚胎時(shí)期的正常和異常發(fā)育情況，如圖1所示。

表2 胚胎期暴露的毒性效應(yīng)Table 2 Chronic toxicity of medaka larvae and embryo at exposure stage

圖1 魚卵及幼魚不同損傷的形態(tài)學(xué)特征(a正常受精魚卵，b正常發(fā)育中的胚胎，c正常后期胚胎，d正常剛孵化幼魚，e卵黃囊腫，f發(fā)育畸形并死亡，g脫殼未出死亡，h尾巴彎曲，i腹部腫大)Fig.1 Characteristics of embryo lesions and larval deformities(a，normal fertilized egg;b，normal embryo;c，normal late embryonic;d，normal larvae;e.yolk cyst;f，development deformity and death embryo;g，inability to break free，h，deformed larvae with curled and distorted tail;i，deformed larvae with swollen abdomen)

2.2.2 魚苗毒性

14 d胚胎孵化試驗(yàn)結(jié)束后，延長(zhǎng)7 d魚苗暴露，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)幼魚的死亡率。如表3所示，3個(gè)廠的進(jìn)水原液和出水原液均對(duì)魚苗產(chǎn)生毒性作用，3個(gè)廠的進(jìn)水原液的魚苗死亡率較高，其中1和3號(hào)的均超過30%。

表3 魚苗期暴露的毒性效應(yīng)Table 2 Chronic toxicity of fish fry at exposure stage

3 討論(Discussion)

Andrea Farwell等［12］和 Zha［13］報(bào)道日本青鳉胚胎孵化時(shí)間為9～14 d，本試驗(yàn)中對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組胚胎的孵化時(shí)間均在9 d左右，說明各水樣對(duì)日本青鳉胚胎沒有造成孵化時(shí)間的影響。原因可能為受精卵的卵膜較堅(jiān)韌，影響孵化時(shí)間的有毒物質(zhì)不能進(jìn)入卵殼內(nèi)［14-15］。由此看來，日本青鳉的胚胎孵化不能作為檢測(cè)污水毒性的生物指示。

3個(gè)污水處理廠進(jìn)水對(duì)青鳉魚的毒性大小為3號(hào)＞1號(hào)＞2號(hào)，原因可能是由于3號(hào)污水中含有周圍印染廠的廢水，造成水的毒性增大。一般印染廢水中含有大量有機(jī)污染物雙酚A(BPA)和胺類等物質(zhì)［16］。Charles A.Staples［17］等人研究雙酚 A 對(duì)癡漢鰷魚早期階段的毒性效應(yīng)，結(jié)果表明BPA在魚類的早期生命階段對(duì)魚卵的孵化率及成活率沒有顯著影響。胺類物質(zhì)在污水中會(huì)發(fā)生物理化學(xué)反應(yīng)形成氨氮等，Helawall［18］研究證明，水中氨氮在堿性環(huán)境中可以水解為非離子氨，然后對(duì)生物體造成毒害作用。由此猜測(cè)3號(hào)污水廠進(jìn)水毒性大于其他兩個(gè)的原因可能是水中含有印染廠廢水帶來的胺類物質(zhì)。在胚胎期暴露中，3個(gè)污水處理廠出水的孵化率與魚苗畸形率均明顯低于進(jìn)水，這說明現(xiàn)有污水處理工藝對(duì)產(chǎn)生這部分效應(yīng)的污染物質(zhì)能夠較好的去除，這一結(jié)果與林建清等人［19］在使用真鯛魚卵為材料對(duì)兩個(gè)污水處理廠不同單元水樣進(jìn)行的魚卵胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中得出的結(jié)果是一致的。但除了3號(hào)污水處理廠出水未檢出明顯魚苗畸形效應(yīng)外，其余出水樣品的孵化率與魚苗畸形率均與對(duì)照產(chǎn)生顯著性差異，這說明能夠影響孵化率與畸形率的污染物仍然存在，也就是排放入環(huán)境水體后仍能夠?qū)λ鷳B(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)。從表2中我們還可以看到，3個(gè)污水處理廠出水顯示出的孵化率與魚苗畸形率均大于10%進(jìn)水的效應(yīng)值，推測(cè)在污水處理廠進(jìn)水中能產(chǎn)生孵化率與畸形率影響的污染物在出水中仍存在大于10%的量，為降低排水對(duì)環(huán)境水體的風(fēng)險(xiǎn)，污水處理廠工藝需要進(jìn)一步優(yōu)化或?qū)Τ鏊鲞M(jìn)一步的處理。

本試驗(yàn)在胚胎孵化成功后繼續(xù)暴露7 d，并在孵化出兩天后進(jìn)行豐年蟲的喂食，進(jìn)出口的污水對(duì)幼苗均產(chǎn)生了致死效應(yīng)，如表4統(tǒng)計(jì)顯示進(jìn)出水的魚苗死亡率均與對(duì)照組產(chǎn)生顯著性差異，其中1號(hào)和3號(hào)進(jìn)水魚苗死亡率高達(dá)30%以上。原因可能是胚胎孵化成功后魚苗的嘴不能及時(shí)張開，不能攝取水環(huán)境中的物質(zhì)，僅能靠吸收腹部卵黃囊中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)維持生命活動(dòng)［20］，而魚苗腹部卵黃囊中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能夠維持魚苗7 d的生理所需。孵化出的畸形幼魚，在魚苗7 d暴露試驗(yàn)中全部死亡，死亡期集中在后幾天。日本青鳉卵黃期一般維持在孵化后2～3 d，由表4可以看出在幼魚7 d暴露試驗(yàn)中，具有顯著死亡效應(yīng)的試驗(yàn)組前3 d魚苗死亡率均在總死亡率的36%以下，隨后幾天的死亡率占總死亡率的63%以上，這期間魚苗死亡主要集中在非卵黃期。這說明導(dǎo)致幼魚死亡的主要原因應(yīng)該是幼魚攝取水中物質(zhì)所致。各水樣對(duì)30 d左右的幼魚均沒有產(chǎn)生毒性效應(yīng)，而對(duì)于早期生命階段的魚產(chǎn)生致死、致畸效應(yīng)，說明早期階段對(duì)有害物質(zhì)更為敏感也更可靠，并且慢性毒性試驗(yàn)可用毒性指標(biāo)比急性毒性試驗(yàn)也更多一些。

綜上所述，得出以下結(jié)論:

(1)各污水廠的進(jìn)出水未對(duì)青鳉幼魚產(chǎn)生急性毒性效應(yīng)，但是在青鳉魚早期階段亞慢性毒性試驗(yàn)中表現(xiàn)出了毒性。在胚胎暴露時(shí)期產(chǎn)生了胚胎致死效應(yīng)以及對(duì)胚胎發(fā)育的致畸效應(yīng)，魚苗暴露期對(duì)新孵化魚苗產(chǎn)生致死效應(yīng)。

(2)青鳉魚早期階段亞慢性毒性方法可靠，除胚胎孵化時(shí)間這一指標(biāo)外，其余指標(biāo)均可以用來評(píng)價(jià)城市污水的綜合毒性。

(3)試驗(yàn)結(jié)果表明各污水廠出水的毒性均低于進(jìn)水，說明污水廠的處理工藝對(duì)污水中的有毒有害物質(zhì)能夠有效去除，但出水仍有一定的毒性效應(yīng)，即出水中仍存在威脅生態(tài)平衡的有害物質(zhì)，這就需要處理工藝的進(jìn)一步完善。

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