張瑩玲，楚占龍，金凡，張玲玉，薛皎亮，謝映平

（山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

蠟蚧霉（Lecanicillium lecanii（Zimmermann））是一種寄生蚧蟲、蚜蟲、粉虱等害蟲的病原真菌［1－2］，用蠟蚧霉制備生物殺蟲劑在害蟲的生物防治中具有廣泛的應(yīng)用前景［3］。真菌殺蟲劑生產(chǎn)過程中主要采用液-固雙相發(fā)酵［4］，固體發(fā)酵是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但目前固體發(fā)酵過程存在培養(yǎng)方式粗放，培養(yǎng)基的碳源和氮源消耗與菌種的孢子產(chǎn)量等指標(biāo)不易監(jiān)測和定量，不同批次之間的質(zhì)量難以控制等問題。

發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是研究發(fā)酵過程中環(huán)境因素與微生物代謝活動(dòng)相互作用隨時(shí)間變化的規(guī)律［5］，建立發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型并對發(fā)酵過程的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析有助于為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。Wang等［6］建立了關(guān)于徑向分布溫度在底物床上生產(chǎn)乙醇的旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器的模型，此模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合度高，可以作為有效的方法去探討固態(tài)發(fā)酵的擴(kuò)大化生產(chǎn)過程；Mitchell等［7］采用時(shí)序模型的方法評估多層次的填充床生物反應(yīng)器作為固體發(fā)酵過程潛在的有利條件，從而提高生物反應(yīng)器的性能。Mazutti等［8］研究了馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）增長和菊粉酶（inulinase）產(chǎn)量的動(dòng)力學(xué)，表明動(dòng)力學(xué)模型有助于放大和優(yōu)化菊粉酶的產(chǎn)量。Rodriguez-Fernandez等［9］采用數(shù)學(xué)模型描述了黑曲霉（Aspergillus niger）在以橘柑皮作為培養(yǎng)基的固態(tài)發(fā)酵中產(chǎn)生的果膠酶和木聚糖酶產(chǎn)量的動(dòng)態(tài)參數(shù)。此外，張新剛等［10］對費(fèi)氏鏈霉菌的分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，表明動(dòng)力學(xué)模型對費(fèi)氏鏈霉菌產(chǎn)新霉素的發(fā)酵生產(chǎn)具有實(shí)際意義；鄭麗雪等［11］對釀酒酵母生產(chǎn)谷胱甘肽分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)建立的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型能較好地反應(yīng)谷胱甘肽的分批發(fā)酵過程。

國內(nèi)外發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究多集中于工業(yè)產(chǎn)品開發(fā)和液體發(fā)酵方面，關(guān)于蠟蚧霉固體發(fā)酵的培養(yǎng)基和發(fā)酵技術(shù)雖有少量報(bào)道［12－16］，但關(guān)于其固體發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究還未見報(bào)道。本文研究蠟蚧霉V3.4505菌株固體發(fā)酵過程中的代謝動(dòng)力學(xué)特性，定量描述發(fā)酵過程中菌體孢子產(chǎn)量與碳源、氮源消耗之間的關(guān)系，建立了動(dòng)力學(xué)模型，獲得模型參數(shù)，以期為蠟蚧霉固體發(fā)酵過程相關(guān)指標(biāo)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測，各批次之間的質(zhì)量控制，規(guī)?；a(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌種

蠟蚧霉V3.4505菌株，購于中國科學(xué)院微生物研究所國家菌種保藏中心，原寄主為稻褐飛虱（Nilaparvata lugens （Stdl））。

1.2 菌株的種子液制備

將培養(yǎng)好的斜面菌種孢子懸浮于無菌的體積分?jǐn)?shù)0.1%吐溫-80水中，制成5.0×107個(gè)／m L的孢子懸液。按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入無菌的液體培養(yǎng)基中（可溶性淀粉40 g；酵母浸出膏10 g；蛋白胨10 g；蒸餾水1 L）（裝量：200 m L／1，000 m L三角瓶），25℃，150 r／min，搖床培養(yǎng)56 h。

1.3 固體發(fā)酵

配置固體培養(yǎng)基5 kg（質(zhì)量分?jǐn)?shù)：稻谷殼50%；麥麩35%；玉米粉15%；蒸餾水250 m L／kg），高壓滅菌后（121℃，30 min），將發(fā)酵培養(yǎng)好的二級種子液，接入固定體培養(yǎng)基中（0.759×107個(gè)／g），攪拌均勻，分別裝入5個(gè)提前消過毒的培養(yǎng)筐中，培養(yǎng)筐為通氣的塑料筐（尺寸：長39.5 cm寬28 cm高15 cm），將培養(yǎng)基平散的鋪在筐內(nèi)紗布上（厚度約3 cm）。在25℃，70%RH的無菌培養(yǎng)室中連續(xù)培養(yǎng)15 d。

1.4 檢測方法

1.4.1 產(chǎn)孢量的測定：培養(yǎng)過程中，每隔36 h取樣1次。將取得的樣品在40℃下烘3 h，取1 g干菌粉，加人50 m L無菌的0.1%吐溫-80水中（150 m L錐形瓶），攪拌均勻，用血球計(jì)數(shù)板測定懸液中的孢子數(shù)量（設(shè)定5個(gè)平行實(shí)驗(yàn)）。

1.4.2 總糖的測定：每隔36 h取樣1次，測定培養(yǎng)基中的總糖含量。采用3，5-二硝基水楊酸比色法［17］（設(shè)定5個(gè)平行實(shí)驗(yàn)）。

1.4.3 總氮的測定：每隔36 h取樣1次，測定培養(yǎng)基中的總氮含量。采用凱氏定氮法［18－19］（設(shè)定5個(gè)平行實(shí)驗(yàn)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程的特征

觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)1 d后，固體培養(yǎng)基中表面可見少量的白色菌絲；1.5 d后產(chǎn)生少量的孢子；3 d后培養(yǎng)基的表面被白色的菌絲和孢子覆蓋；培養(yǎng)5～6 d時(shí)，培養(yǎng)基內(nèi)也布滿了菌絲和孢子。

2.2 菌株產(chǎn)孢量隨培養(yǎng)時(shí)間的變化

通過對菌株產(chǎn)孢量的連續(xù)檢測，發(fā)現(xiàn)菌株生長經(jīng)歷了緩慢生長期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定生長期3個(gè)階段（圖1）。從接種后培養(yǎng)到第1.5天，菌體生長較慢，孢子產(chǎn)量增長只有0.510 8×107個(gè)／g，為緩慢生長期；第1.5天到第9天菌體生長很快，為對數(shù)生長期，孢子產(chǎn)量很快增長到8.901 2×107個(gè)／g；第9天開始進(jìn)入穩(wěn)定生長期，菌體的生長速率變緩，呈現(xiàn)較為穩(wěn)定的特點(diǎn)。

2.3 底物消耗的變化

菌株固體培養(yǎng)過程中碳源和氮源的消耗測定結(jié)果顯示（圖2），在菌體緩慢生長期，碳源和氮源的消耗也較少，分別為3%和10%；進(jìn)入對數(shù)生長期，菌體生長對底物的消耗量急劇加大，碳源消耗迅速，到第6天其消耗率高達(dá)38%；從7.5 d后開始進(jìn)入穩(wěn)定期，底物消耗的速度也變得緩慢，較為穩(wěn)定，碳源消耗率一直保持在3%以內(nèi)，這與菌體生長曲線的3個(gè)階段相對應(yīng)。氮源的快速消耗出現(xiàn)在前3天，其消耗率達(dá)到17%。第3天后氮源的消耗量減少，處于動(dòng)態(tài)平衡的趨勢，消耗率一直保持在5%以內(nèi)。這可能是由于菌體在生長過程中對氮源的利用比碳源相對較少引起的。

Flg.1 Spore production curve in the solid-state fermentation by Lecanicillium lecanii圖1 蠟蚧霉固體發(fā)酵產(chǎn)孢量變化曲線

Fig.2 Substrate consumption curve in the solid-state fermentation by Lecanicillium lecanii圖2 蠟蚧霉固體發(fā)酵底物變化曲線

2.4 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立

根據(jù)以上的數(shù)據(jù)可以建立菌體的產(chǎn)孢量的增長與底物消耗之間相關(guān)性的動(dòng)力學(xué)模型。菌體在對數(shù)生長期生長迅速，所以消耗底物的速度最快，特別是對碳源的消耗量大。在菌體穩(wěn)定生長期，底物的消耗量減少，碳源和氮源消耗的變化都趨向于一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)。由此可以得出，菌體在發(fā)酵過程中的生長速率和底物的消耗速率是相關(guān)的。在此對蠟蚧霉V3.4505菌體生長和底物（總糖和總氮）消耗動(dòng)力學(xué)進(jìn)行擬合研究。

2.4.1 菌體生長動(dòng)力學(xué)擬合：Verhulst-Pearl提出的Logistic方程能夠很好地反映分批發(fā)酵過程中菌體生長的一般規(guī)律，常用于菌體生長動(dòng)力學(xué)描述，是目前應(yīng)用較為普遍的方程之一［20－21］。由于蠟蚧霉生長曲線為S形，由此可得菌體生長的Logistic方程［22］：

式中，Um為菌體最大比生長速率；Cx為菌體濃度；Cm為菌體最大濃度。Um、Cm為常數(shù)。

當(dāng)t＝0時(shí)，Cx＝C0，方程積分變換為：

當(dāng)初始條件t＝0時(shí)，菌絲體濃度Cx等于接種后的菌絲體濃度。而最大比生長速率Um是以ln［Cx／（Cm－Cx）］對t作圖所得到的直線斜率，截距為ln［Cx／（Cm－Cx）］。

則Um＝0.748 5 d－1.

整理后，發(fā)酵菌體生長動(dòng)力學(xué)模型為：

式中，t的單位為d表示。將模擬計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

Fig.3 Comparison of the kinetic model of spore production with experimental data圖3 產(chǎn)孢量動(dòng)力學(xué)模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比擬

2.4.2 底物消耗動(dòng)力學(xué)擬合：由蠟蚧霉培養(yǎng)曲線（圖1）可知，隨著菌體的培養(yǎng)，底物中總糖和總氮含量不斷下降，總糖含量的下降顯示培養(yǎng)基為菌體生長提供了所需的碳源。把糖和氮作為限制性底物，在此基礎(chǔ)上底物消耗的動(dòng)力學(xué)方程可表示為［23－24］：

其中b2＝1／Yx／s，式中的Yx／s是菌體對底物得率，1／Yx／s是底物對菌體的消耗率。

將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，求出回歸系數(shù)。依據(jù)菌體生長動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)，求得底物消耗動(dòng)力學(xué)模型為：

根據(jù)以上動(dòng)力學(xué)方程，繪制動(dòng)力學(xué)模型與測定值比較曲線。

將蠟蚧霉V3.4505菌株固體發(fā)酵過程中的產(chǎn)孢量與底物中的總糖和總氮的實(shí)驗(yàn)值與模擬值列入表1，經(jīng)計(jì)算后可以看出它們的實(shí)驗(yàn)值與模擬值之間的平均相對誤差。在表1中以孢子產(chǎn)量結(jié)合底物的消耗的實(shí)驗(yàn)值與模擬值之間的誤差大部分小于10%，但是其中3～6 d期間的誤差較大，有的甚至達(dá)到17.5%，結(jié)合圖4和圖5可以看出，總糖和總氮的實(shí)驗(yàn)值與模擬值擬合度較高，分別為0.834 2和0.744 6.說明該模型能夠較好地反應(yīng)該菌體生長的實(shí)際情況和發(fā)酵過程中總糖和總氮的消耗關(guān)系。

Fig.4 Comparison of kinetic model of total sugar with experimental data圖4 總糖消耗動(dòng)力學(xué)模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比擬

Fig.5 Comparison of kinetic model of total nitrogen with experimental data圖5 總氮消耗動(dòng)力學(xué)模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比擬

表1 產(chǎn)孢量和底物消耗測定值與模型計(jì)算值對比及誤差表Table 1 Spore production and substrate consumption measured values calculated with the model comparison and error

3 討論

考慮到菌種大批量生產(chǎn)的成本問題，固體培養(yǎng)基成分中稻谷殼占到50%。稻谷殼不僅為菌體生長提供營養(yǎng)，還改善了培養(yǎng)基的疏松度，利于通氣和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的熱量散出，易于菌體生長。但是從蠟蚧霉菌體生長曲線（圖1）看出，在發(fā)酵前期菌體要經(jīng)歷緩慢生長期，而稻谷殼中的纖維素含量較高，需要分解后才能被菌體吸收利用，因此，在實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)中可以考慮在培養(yǎng)基中加入適量的葡萄糖作為碳源，或其它能夠幫助迅速降解培養(yǎng)基底物的酶類，以加速菌體前期的生長。研究中菌種固體培養(yǎng)是15 d，但從圖1可以看出，菌體產(chǎn)孢量從第9天后進(jìn)入穩(wěn)定期；從圖2可以看出，總糖的消耗量從7.5 d后進(jìn)入穩(wěn)定期，結(jié)合兩張圖可以得出在10 d時(shí)就可以進(jìn)入蠟蚧霉的收獲期，這可作為實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)中縮短菌體的培養(yǎng)周期和提高培養(yǎng)效率的參考。

本研究對蠟蚧霉V3.4505菌株發(fā)酵過程進(jìn)行了初步的動(dòng)力學(xué)研究，建立了以菌體產(chǎn)孢量為目標(biāo)結(jié)合底物消耗的數(shù)學(xué)模型，其中總糖和總氮消耗模型的擬合度為0.834 2和0.744 6.結(jié)果表明所得模型較好地反映了菌株的生長動(dòng)力過程及底物消耗情況，可以用來預(yù)測固體發(fā)酵過程中菌體生長、底物消耗的動(dòng)力學(xué)關(guān)系，為實(shí)際生產(chǎn)中各項(xiàng)指標(biāo)的監(jiān)測和判斷發(fā)酵是否正常提供了理論依據(jù)。

［1］ Sung G H，Sung J M，Hywel-Jones N L.A Multi-gene Phylogeny of Clavicipitaceae（Ascom ycota，F(xiàn)ungi）：Identification of Localized Incongruence Using a Combinational Bootstrap Approach［J］.MolecularPhylogeneticsandEvolution，2007，44：1204-1223.

［2］ Evans H C，Hywel-Jones N L.Entomopathogenic Fungi［M］／／Ben-Dow Y，Hodgson CJ（Eds.），Soft Scale Insects：Their Biology，Natural Enemies and Control.Elsevier，Amsterdam ＆ New York，1997，7B：15-16.

［3］ Shah P A，Pell J K.Entomopathogenic Fungi as Biological Control Agents［J］.Applied Microbiology Biotechnology，2003，61：413-423.

［4］ Feng M G，Poprawski T J，Khachatourians G G.Production，F(xiàn)ormulation and Application of the Entomopathogenic Fungus Beauveria Bassiana for Insect Control：Current Status［J］.Biocontrol Science and Technology，1994，4（1）：3-34.

［5］ Zhao B，Wang L，Li F，et al.Kinetics of D-lactic Acid Production by Sporolactobacillus sp.Strain CASD using Repeated Batch Fermentation［J］.Bioresource Technology，2010，101（16）：6499-6505.

［6］ Wang E Q，Li S Z，Tao L，et al.Modeling of Rotating Drum Bioreactor for Anaerobic Solid-state Fermentation ［J］.Applied Energy，2010，87：2839-2845.

［7］ Mitchell D A，Cunha L E N，Machado A V L，et al.A Model-based Investigation of the Potential Advantages of Multi-layer Packed Beds in Solid-state Fermentation［J］.Biochemical Engineering Journal，2010，48：195-203.

［8］ Mazutti M A，Zabot G，Boni G，et al.Kinetics of Inulinase Production by Solid-state Fermentation in a Packed-bed Bioreactor［J］.Food Chemistry，2010，120：163-173.

［9］ Rodriguez-Fernandez D E，Rodriguez-Leon J A，de Carvalho J C，et al.The Behavior of Kinetic Parameters in Production of Pectinase and Xylanase by Solid-state Fermentation［J］.Bioresource Technology，2011，102：10657-10662.

［10］ 張新剛，史冠瑩，陶科，等.費(fèi)氏鏈霉菌 HTP6分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2009，36（3）：311-315.

［11］ 鄭麗雪，王立梅，梅艷珍，等.釀酒酵母生產(chǎn)谷胱甘肽分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究［J］.食品科學(xué)，2011，32（1）：158-161.

［12］ Soni N，Prakash S.Larvicidal Effect of Verticillium Lecanii Metabolites on Culex Quinquefasciatus and Aedes Aegypti Larvae［J］.Asian Pacific Journal of Tropical Disease，2012，2（3）：220-224.

［13］ Liu B L，Kao P M，Tzeng Y M，et al.Production of Chitinase from Verticillium Lecanii F091 Using Submerged Fermentation ［J］.Enzyme and Microbial Technology，2003，33（4）：410-415.

［14］ 李國霞，高希武，劉青春，等.蠟蚧輪枝菌的發(fā)酵技術(shù)及其代謝產(chǎn)物對害蟲毒殺作用的初步研究［J］.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，21（4）：409-415.

［15］ 謝明，邱衛(wèi)亮，萬方浩，等.蠟蚧輪枝菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選［C］／／胡萃，陳家安.城市昆蟲學(xué)進(jìn)展.全國城市昆蟲學(xué)術(shù)討論會(huì)證文集.杭州：浙江大學(xué)出版社，2001：173-177.

［16］ 李峰，陰華，蔣繼宏，等.蠟蚧輪枝菌固體培養(yǎng)條件研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，32（4）：57-59.

［17］ 黃翊鵬，祁靜，鄭亞軍，等.3，5-二硝基水楊酸法測定椰子納塔發(fā)酵液中總糖含量研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，12：171-174.

［18］ 中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)發(fā)布.食品中蛋白質(zhì)的測定［S］.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)，GB／T5009.5-2003.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004：35-41.

［19］ 孔祥平，王娟，曲秋世，等.凱氏定氮法測定蝦殼中氮含量［J］.實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2011，30（6）：37-39.

［20］ 張龍翔，張庭芳，李令媛.生化試驗(yàn)方法和技術(shù)［M］.北京：高等教育出版社，1997：1-3.

［21］ 殷祚云.Logistic曲線擬合方法研究［J］.數(shù)理統(tǒng)計(jì)與管理，2002，21（1）：41-46.

［22］ 倫世儀.生化工程 ［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1993：113-114.

［23］ 房耀維，余勃，劉姝，等.有機(jī)溶劑穩(wěn)定性蛋白酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究［J］.食品科學(xué)，2012，33（23）：240-243.

［24］ 林巧，李燕紅，孫小波，等.櫻桃果酒發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究［J］.中國釀造，2009，28（7）：65-68.

［25］ Weiss R M，Ollis D F.Extracellular Microbial Polysaccharides I.Substrate，Biomass，and Product Kinetic Equations for Batch Xanthan Gum Fermentation ［J］.Biotechnology and Bioengineering，1980，22（4）：859-873.