郭奕斌

中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，廣州 510080

準(zhǔn)確、快速地獲取生物體的遺傳信息對(duì)生命科學(xué)研究具有十分重要的意義。對(duì)于基因病，基因診斷特別是測(cè)序技術(shù)被公認(rèn)是確診該類疾病最準(zhǔn)確、最可靠的診斷技術(shù)和金標(biāo)準(zhǔn)，它可以在基因水平甚至在單個(gè)堿基發(fā)生改變的情況下作出明確診斷，還可以在全基因組水平查出任何堿基的改變。近十幾年來(lái)，測(cè)序技術(shù)取得了前所未有的進(jìn)步，在基礎(chǔ)研究和臨床檢測(cè)中已日益顯出廣闊的應(yīng)用前景。從測(cè)序技術(shù)的發(fā)展歷程來(lái)看，它經(jīng)歷了從簡(jiǎn)單到復(fù)雜，從單一到全面和多功能，從時(shí)間長(zhǎng)、成本高、通量低、手工操作到快速、廉價(jià)、高通量、自動(dòng)化，從多細(xì)胞到單分子、用量多到用量少的過(guò)程。本文重點(diǎn)對(duì)第一～三代測(cè)序技術(shù)的原理、優(yōu)缺點(diǎn)及其在基因診斷中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，并對(duì)基因診斷和測(cè)序技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了預(yù)測(cè)和展望。

1 測(cè)序技術(shù)的研究進(jìn)展及優(yōu)缺點(diǎn)

DNA測(cè)序技術(shù)是基因診斷技術(shù)發(fā)展史上具有里程碑、劃時(shí)代的技術(shù)革命，被稱為是基因診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。從 1977年 Sanger發(fā)明鏈末端終止法測(cè)序(Sanger sequencing)[1]開(kāi)始，至今已有 30多年，在基因病特別是單基因病的基因診斷和產(chǎn)前/植入前診斷中廣為使用。直到2007年，Roche公司[2,3]、Illumina公司[4～6]、ABI公司[7,8]發(fā)明了高通量測(cè)序技術(shù)(High-throughput sequencing)，即下一代測(cè)序技術(shù)(Next generation sequencing, NGS)[9]，才步入一個(gè)新的測(cè)序時(shí)代。然而，測(cè)序技術(shù)的發(fā)展并非就此止步，更新的產(chǎn)品——以單分子實(shí)時(shí)測(cè)序和納米孔技術(shù)為標(biāo)志的第三代測(cè)序[10]也已登上歷史舞臺(tái)。

1.1 雙脫氧鏈終止法測(cè)序：第一代測(cè)序技術(shù)

該技術(shù)始于 1977年 Sanger發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法以及Maxam和Gilbert發(fā)明的化學(xué)裂解法[1,11]。在過(guò)去的30年里，因測(cè)序讀長(zhǎng)(read length)長(zhǎng)、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，Sanger測(cè)序技術(shù)一直占據(jù)著統(tǒng)治地位。

1.1.1 原理

雙脫氧鏈終止法是利用一種 DNA聚合酶來(lái)延伸結(jié)合在待測(cè)DNA模板上的引物，直到摻入1種鏈終止核苷酸(ddNTP)為止。每一次測(cè)序都由一套4個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)構(gòu)成，每個(gè)反應(yīng)含有4種脫氧核苷三磷酸(dNTPs)，并混入一定量的1種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于 ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長(zhǎng)的寡聚核苷酸選擇性地在A、T、G或C處終止。終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的ddNTP而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對(duì)濃度都可以調(diào)整，這樣可得到一組長(zhǎng)幾百至上千堿基的鏈終止產(chǎn)物。這些產(chǎn)物具有共同的起始點(diǎn)，但終止點(diǎn)不同，通過(guò)變性凝膠電泳可分離出大小不同的片段。將凝膠處理后再用X光片同位素放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)[1,12]，或通過(guò)高分辨率毛細(xì)管電泳分離大小不同的片段并通過(guò)熒光標(biāo)記識(shí)別片段末端堿基，從而獲得所測(cè)片段的堿基序列[13]。該方法在20世紀(jì)70年代是用同位素標(biāo)記，手工操作，產(chǎn)物是用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離[1,11]；80年代改用熒光標(biāo)記，自動(dòng)測(cè)序，產(chǎn)物用平板電泳分離[14,15]；90年代再改用毛細(xì)管電泳技術(shù)及微陣列毛細(xì)管電泳技術(shù)，使得測(cè)序的通量大為提高[13]。

化學(xué)裂解法是先對(duì)DNA末端進(jìn)行放射性標(biāo)記，再使用特殊的化學(xué)試劑進(jìn)行降解，這些化學(xué)試劑均能對(duì)1個(gè)或者2個(gè)堿基發(fā)生專一性斷裂，最后通過(guò)PAGE、放射自顯影技術(shù)讀取待測(cè)的DNA片段。由于該方法程序復(fù)雜、操作繁瑣，后來(lái)逐漸被 Sanger法取代。

1.1.2 優(yōu)點(diǎn)

第一代測(cè)序技術(shù)可用于已知或未知突變的檢測(cè)，與其他基因檢測(cè)方法如 SSCP(Single strand conformation polymorphism)、DHPLC(Denaturing highperformance liquid chromatograph)、ASA(Allele-specific amplification)、HET(Heteroduplex analysis)、DGGE(Denaturing gradinent gel electrophoresis)、TGGE(Temperature gradient gel electrophoresis)、HRM(Highresolution melting curve analysis)等相比，DNA測(cè)序常被用作標(biāo)準(zhǔn)的鑒定方法以及最終確定突變的確切位點(diǎn)和突變性質(zhì)的手段。檢測(cè)的突變類型包括錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、同義突變(含 SNP)、拼接突變、小缺失、小插入、大缺失、大插入、插入伴缺失、復(fù)雜重排、重復(fù)變異等，準(zhǔn)確率近100%。該法特別適用于單基因病的基因診斷和產(chǎn)前診斷。

1.1.3 缺點(diǎn)

第一代測(cè)序技術(shù)只能在 PCR擴(kuò)增后才能測(cè)序(直接測(cè)序或克隆測(cè)序)，且只能逐段測(cè)序即只能分析單個(gè)的DNA片段，通量小，無(wú)法完成全基因組層面的分析。測(cè)序成本高(據(jù)估算，用該法完成人類基因組計(jì)劃，需花 30億美元)，數(shù)據(jù)分析量大，自動(dòng)化程度不高或需手工操作，一些PCR產(chǎn)物不能被分析而需制備單克隆。另外，該法速度慢，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)(據(jù)估算，用該法完成人類全基因組的測(cè)序，至少需用時(shí)3年。而使用第二代SOLiD測(cè)序技術(shù)，測(cè)定一個(gè)人的基因組只需1周左右)，對(duì)于需要快速檢測(cè)的植入前遺傳學(xué)診斷(Preimplantation genetic diagnosis，PGD)來(lái)說(shuō)，該法不太合適，至少不能作為唯一的檢測(cè)方法。因?yàn)榧词故乾F(xiàn)在，也無(wú)法保證測(cè)序公司一定能在24 h內(nèi)給出所測(cè)片段(哪怕是數(shù)百個(gè)堿基對(duì))的結(jié)果。

第一代測(cè)序技術(shù)，不管是Sanger的雙脫氧鏈終止法還是Maxam和Gilbert的化學(xué)裂解法，都需要放射性同位素標(biāo)記，操作繁瑣且不能自動(dòng)化，故無(wú)法滿足大規(guī)模測(cè)序的要求。另外，毛細(xì)管微陣列DNA測(cè)序在成本與耗時(shí)方面也遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了基因組學(xué)發(fā)展的需要[16,17]。

1.1.4 應(yīng)用

第一代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用非常廣泛，在基因病特別是單基因病現(xiàn)癥病人和攜帶者的基因診斷、高危胎兒的產(chǎn)前基因診斷乃至胚胎植入前基因診斷方面都是不可或缺的診斷手段，從發(fā)明至今，雖已過(guò)去30多年，但仍一直作為基因診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。其臨床應(yīng)用實(shí)例不勝枚舉，包括：G6PD缺乏癥、地中海貧血、異常血紅蛋白病、血友病等遺傳性血液病，黏多糖貯積癥各種類型、糖原貯積癥Ⅱ型，黏脂質(zhì)貯積癥、神經(jīng)鞘脂貯積癥等溶酶體貯積癥，白化病、苯酮尿癥、半乳糖血癥、自毀容貌綜合征等遺傳性酶病，成骨不全各種類型、軟骨發(fā)育不全、致死性侏儒癥、假性軟骨發(fā)育不全、多發(fā)性骨骺發(fā)育不良、遲發(fā)性脊椎骨骺發(fā)育不良、先天性脊柱骨骺發(fā)育不良、低血磷抗維生素D佝僂病等遺傳性骨病，等等。

1.2 高通量測(cè)序：第二代測(cè)序技術(shù)

基因診斷的快速發(fā)展，客觀上需要對(duì)大規(guī)?；蚪M進(jìn)行更加精細(xì)的研究，這就要求深度測(cè)序以及重復(fù)測(cè)序，而通量低、成本高、檢測(cè)耗時(shí)的第一代測(cè)序技術(shù)顯然不能滿足這種要求。因此以高通量、低成本、自動(dòng)化程度高為顯著特征的第二代測(cè)序技術(shù)誕生了，它能在很短的時(shí)間內(nèi)完成對(duì)上百億個(gè)堿基對(duì)的測(cè)序，一次可對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，滿足極短時(shí)間內(nèi)對(duì)基因組進(jìn)行高分辨率檢測(cè)的要求[7,9,18]。高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)的一次革命性的改變，被稱為NGS(Next generation sequencing)，足見(jiàn)其劃時(shí)代的進(jìn)步和意義。該技術(shù)提供了一種與基因芯片技術(shù)互為補(bǔ)充的新的高通量工具，能對(duì)一個(gè)物種的基因組和轉(zhuǎn)錄組的全貌進(jìn)行全面細(xì)致的分析，故又被稱為深度測(cè)序(Deep sequencing)。根據(jù)發(fā)展史、影響力、測(cè)序原理和技術(shù)的不同，可分為：大規(guī)模平行簽名測(cè)序(Massively parallel signature sequencing, MPSS)、聚合酶克隆測(cè)序(Polony sequencing)、454焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing, Roche/454)、合成測(cè)序(Sequencing-by-synthesis, SBS, Illumina/Solexa)、連接測(cè)序(Sequencing-by-ligation, ABI/SOLiD)、離子半導(dǎo)體測(cè)序(Ion semiconductor sequencing)、DNA納米球測(cè)序(DNA nanoball sequencing)、基因組擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄同步測(cè)序(Genomic amplification with transcript sequencing, GAWTS)等[7,8,12,19]。其中，Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)是第二代測(cè)序技術(shù)的代表[9]。它們都有一個(gè)共同之處：均使用反應(yīng)信號(hào)的實(shí)時(shí)閱讀，在測(cè)序反應(yīng)進(jìn)行的同時(shí)，收集反應(yīng)信號(hào)，因此測(cè)序成本大幅度降低。下文以Illumina Genome AnalyzerIIx為代表介紹NGS的測(cè)序原理。

1.2.1 原理

Illumina Genome AnalyzerIIx是一種基于單分子簇(Cluster)的邊合成邊測(cè)序技術(shù)，是基于專有的可逆終止化學(xué)反應(yīng)的原理。測(cè)序時(shí)將基因組DNA的隨機(jī)片段附著到光學(xué)透明的玻璃表面(即流動(dòng)槽Flow cell)，這些DNA片段經(jīng)過(guò)延伸和橋式擴(kuò)增后，在Flow cell上形成數(shù)以億計(jì)的Cluster，每個(gè)Cluster是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團(tuán)的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過(guò)可逆性終止的邊合成邊測(cè)序(SBS)技術(shù)對(duì)待測(cè)的模板DNA進(jìn)行測(cè)序[18,20]。

1.2.2 優(yōu)點(diǎn)

NGS具有高通量、高準(zhǔn)確性、高靈敏度、自動(dòng)化程度高和低運(yùn)行成本等突出優(yōu)勢(shì)，可以同時(shí)完成傳統(tǒng)基因組學(xué)(測(cè)序和注釋)和功能基因組學(xué)(基因表達(dá)及調(diào)控、基因功能、蛋白/核酸相互作用)的研究[18,20]。對(duì)還沒(méi)有參考序列的物種進(jìn)行從頭測(cè)序，可獲得該物種的參考序列[21]；對(duì)有參考序列的物種，進(jìn)行全基因組重測(cè)序(Resequencing)，可在全基因組水平上檢出突變位點(diǎn)，從而發(fā)現(xiàn)個(gè)體的分子差異[22]。該技術(shù)適用于未知物種、未知基因的檢測(cè)。通過(guò)全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(Whole transcriptome resequencing, WTR)，可開(kāi)展可變剪接、編碼序列單核苷酸多態(tài)性(cSNP)的研究，或者進(jìn)行小分子RNA測(cè)序，從而發(fā)現(xiàn)新的microRNA分子[23,24]。與染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)和甲基化DNA免疫共沉淀(MeDIP)技術(shù)相結(jié)合，可檢出與特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的 DNA區(qū)域和基因組上的甲基化位點(diǎn)[25,26]。

NGS技術(shù)極大地促進(jìn)了胎兒游離 DNA(Cell free fetal DNA, cffDNA)的實(shí)驗(yàn)室研究，促進(jìn)了無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前基因診斷的發(fā)展[27]。目前基于 NGS平臺(tái)，建立胎兒21、18、13三體綜合征的產(chǎn)前基因診斷技術(shù)已應(yīng)用于臨床，其他如性染色體非整倍體、雙胎妊娠染色體非整倍體、胎兒染色體結(jié)構(gòu)異常疾病、孟德?tīng)枂位虿∫约叭焉锵嚓P(guān)疾病的研究也因NGS的出現(xiàn)獲得了顯著的進(jìn)步[28,29]。

1.2.3 缺點(diǎn)

相對(duì)而言，工作量仍較大，費(fèi)用仍較高，不適合用于序列已知的單基因病的突變檢測(cè)。該技術(shù)仍需要PCR擴(kuò)增環(huán)節(jié)，相對(duì)于第三代測(cè)序技術(shù)來(lái)說(shuō)，通量還不夠高，讀長(zhǎng)還比較短，時(shí)間還不夠快，所需模板用量還比較多，故無(wú)法在單細(xì)胞、單分子水平進(jìn)行檢測(cè)。

值得一提的是，第二代測(cè)序結(jié)合微陣列技術(shù)已衍生出目標(biāo)序列捕獲測(cè)序技術(shù)(Targeted resequencing)[30]。這項(xiàng)技術(shù)首先利用微陣列技術(shù)合成大量寡核苷酸探針，這些寡核苷酸探針能夠與基因組上的特定區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，從而富集到特定區(qū)段，然后用NGS 對(duì)這些區(qū)段進(jìn)行測(cè)序。目前應(yīng)用最多的是人外顯子組捕獲測(cè)序[31]。外顯子組測(cè)序比全基因組重測(cè)序更有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗粌H費(fèi)用較低，數(shù)據(jù)分析計(jì)算量較小，而且與生物學(xué)表型結(jié)合更為直接。外顯子組測(cè)序也稱全外顯子測(cè)序(Whole-exome sequencing,WES)[19]，是利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域的 DNA捕捉并富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的基因組分析方法，是一種選擇基因組編碼序列的高效方法。其實(shí)驗(yàn)流程是：基因組DNA的制備及檢測(cè)→構(gòu)建片段文庫(kù)→目標(biāo)片段的富集→富集文庫(kù)的擴(kuò)增→文庫(kù)質(zhì)量的檢測(cè)→高通量測(cè)序。

1.2.4 應(yīng)用

第二代測(cè)序技術(shù)近年來(lái)發(fā)展很快，應(yīng)用也日益廣泛，其應(yīng)用范圍包括：(1) 基因組學(xué)(全基因組De novo測(cè)序、全基因組重測(cè)序、外顯子和目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序)；(2) 轉(zhuǎn)錄組學(xué)(轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序、小RNA測(cè)序、降解組測(cè)序)；(3) 表觀組學(xué)(甲基化測(cè)序、RRBS測(cè)序、MeDIP測(cè)序、ChIP測(cè)序[32])。

目前，高通量測(cè)序主要應(yīng)用于尋找疾病的候選基因，可用于單基因病、復(fù)雜疾病(如糖尿病、肥胖癥等)甚至是癌癥的致病基因或易感基因的尋找。對(duì)于疑難病癥，在第一代測(cè)序技術(shù)仍檢測(cè)不出的情況下，可考慮采用NGS。

Schinzel-Giedion綜合征是一種導(dǎo)致嚴(yán)重智力缺陷、腫瘤高發(fā)以及多種先天性畸形的罕見(jiàn)病。內(nèi)梅亨大學(xué)的研究人員使用Agilent SureSelect序列捕獲和SOLiD技術(shù)對(duì)4位患者的外顯子組進(jìn)行測(cè)序，平均覆蓋度為43倍，讀長(zhǎng)為50 nt，每個(gè)個(gè)體產(chǎn)生了2.7～3 GB可作圖的序列數(shù)據(jù)。他們將目光聚中于每位患者都攜帶有變異體的12個(gè)基因上，最終將候選基因縮減至 1個(gè)，并鑒定出 Schinzel-Giedion 綜合征中的致病突變[18,33,34]。貝勒醫(yī)學(xué)院基因組測(cè)序中心也計(jì)劃對(duì) Science雜志報(bào)道的十大科學(xué)突破的 15種疾病包括腦癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、膀胱癌、心臟病、糖尿病、自閉癥以及其他遺傳病進(jìn)行研究，以便更好地理解致病突變以及突變對(duì)疾病的影響[18,35]。

1.3 單分子DNA測(cè)序：第三代測(cè)序技術(shù)

第三代測(cè)序技術(shù)是指在單個(gè)細(xì)胞、單分子水平上對(duì)基因組進(jìn)行測(cè)序的一項(xiàng)新技術(shù)。2007年以來(lái)，NGS平臺(tái)已經(jīng)大規(guī)模普及。同時(shí)，人類單倍型計(jì)劃、千人基因組計(jì)劃、癌癥基因組計(jì)劃、Meta-Hit計(jì)劃等重大國(guó)際合作項(xiàng)目也將基因組研究日益推向高潮。然而迄今為止，使用的測(cè)序材料無(wú)一例外都是大量細(xì)胞混合的DNA樣本。在微生物生態(tài)學(xué)、癌癥基因組、法醫(yī)學(xué)、微量診斷、遺傳印記等研究中，這樣的材料顯然無(wú)法滿足要求，而以單分子實(shí)時(shí)測(cè)序和納米孔技術(shù)為標(biāo)志的第三代測(cè)序[36～42]則為解決上述難題打開(kāi)了嶄新的大門(mén)。不同于NGS依賴于DNA模板PCR擴(kuò)增，使 DNA模板與固體表面相結(jié)合然后邊合成邊測(cè)序的方法，第三代測(cè)序?yàn)閱畏肿訙y(cè)序，不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增。主要包括：Helico Bioscience單分子測(cè)序技術(shù)[36,43～45]；Pacific Bioscience單分子實(shí)時(shí)(Single molecule real time, SMRT)測(cè)序技術(shù)[46,47]和 Oxford Nanopore納米孔單分子測(cè)序技術(shù)[10,37,40～42,48]3種。其中，Nanopore技術(shù)是一種很有發(fā)展?jié)摿Φ臒o(wú)標(biāo)記測(cè)序方法。第三代測(cè)序的流程如圖1所示。

1.3.1 原理

Helico Bioscience單分子測(cè)序和 Pacific Bioscience的SMRT測(cè)序技術(shù)的原理：脫氧核苷酸用熒光標(biāo)記，顯微鏡實(shí)時(shí)記錄熒光的強(qiáng)度變化。當(dāng)熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸被摻入DNA鏈的時(shí)候，它的熒光就能同時(shí)在DNA鏈上探測(cè)到。當(dāng)它與DNA鏈形成化學(xué)鍵的時(shí)候，它的熒光基團(tuán)就被 DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸不會(huì)影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA鏈和天然的DNA鏈完全一樣[51]。

Oxford Nanopore納米孔單分子測(cè)序的原理：用α-溶血素構(gòu)建生物納米孔，讓核酸外切酶附著在堿基將落入的孔的一側(cè)的外表面，而讓一種合成的環(huán)糊精作為傳感器共價(jià)結(jié)合到納米孔的內(nèi)表面，將這個(gè)系統(tǒng)鑲嵌在一個(gè)脂質(zhì)雙分子層內(nèi)。為了提供既符合不同堿基檢測(cè)又滿足外切酶活性的物理?xiàng)l件，需事先將脂質(zhì)雙分子層兩側(cè)調(diào)為不同的鹽濃度。在適合的電壓下，核酸外切酶消化單鏈DNA，單個(gè)堿基落入孔中，并與孔內(nèi)的環(huán)糊精短暫作用，從而影響流過(guò)納米孔的原本的電流。腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T)的電信號(hào)大小很接近，但T在環(huán)糊精停留的時(shí)間是其他核苷酸的 2～3倍，鳥(niǎo)嘌呤(G)和胞嘧啶(C)各自停留的時(shí)間也不同，所以每個(gè)堿基都因有特有的電流干擾振幅而被區(qū)分開(kāi)來(lái)。另外，由于甲基化的 C在環(huán)糊精的停留時(shí)間約為正常C停留時(shí)間的兩倍，所以通過(guò)納米孔檢測(cè)還可以直接讀取甲基化的 C。納米孔單分子測(cè)序的精確率可達(dá)99.9999%，而且被檢測(cè)過(guò)的堿基能很快地從納米孔清除而不會(huì)出現(xiàn)重復(fù)測(cè)序[52]。

1.3.2 優(yōu)點(diǎn)

第三代測(cè)序技術(shù)具有諸多優(yōu)點(diǎn)，具體表現(xiàn)在：

(1) 該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可測(cè)10個(gè)堿基，測(cè)序速度是化學(xué)測(cè)序法的2萬(wàn)倍[18,51]；

(2) 它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的延續(xù)性，一個(gè)反應(yīng)就可以測(cè)非常長(zhǎng)的序列。NGS可以測(cè)上百個(gè)堿基，而該技術(shù)可以測(cè)幾千個(gè)堿基。精度非常高，可達(dá)99.9999%[18,51]；

(3) 可以直接測(cè) RNA的序列。RNA的直接測(cè)序，將大大降低體外逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差[18,51]；

圖1 單細(xì)胞測(cè)序流程[49,50]

(4) 直接測(cè)甲基化的 DNA序列。DNA聚合酶復(fù)制A、T、C、G的速度是不一樣的，用正常的C或者甲基化的C為模板，DNA聚合酶停頓的時(shí)間也是不同的。根據(jù)這個(gè)時(shí)間差，即可判斷模板的C是否甲基化[51]；

(5) 結(jié)合外顯子捕獲測(cè)序技術(shù)，可獲得大量重要變異，節(jié)省項(xiàng)目成本；

(6) 可挖掘DNA突變的來(lái)源和頻率，結(jié)果驗(yàn)證率高；

(7) 能分析癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展和演化過(guò)程；

(8) 能將正常細(xì)胞與癌細(xì)胞在遺傳變異水平上區(qū)分開(kāi)來(lái)；

(9) 對(duì)于基因組測(cè)序來(lái)說(shuō)，由于具有讀長(zhǎng)長(zhǎng)的特點(diǎn)，SMRT測(cè)序平臺(tái)在基因組測(cè)序中能降低測(cè)序后Contig(片段重疊群)的數(shù)量，明顯減少后續(xù)基因組拼接和注釋的工作量，可節(jié)省大量的時(shí)間，比起NGS能更快獲得結(jié)果。因此在鑒定細(xì)菌和新的病原體的基因組測(cè)序方面得到廣泛的應(yīng)用；

(10) 用于病理性突變鑒定或SNP檢測(cè)時(shí)，單分子測(cè)序的分辨率具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)，而且不用PCR擴(kuò)增步驟，也就不會(huì)有擴(kuò)增引入的堿基錯(cuò)誤。該優(yōu)勢(shì)使其在特定序列的SNP檢測(cè)，稀有突變及其頻率測(cè)定中大顯身手。在產(chǎn)前診斷特別是胚胎植入前診斷方面具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)；

(11) 基因組測(cè)序適用的細(xì)胞類型多，除了不同組織不同分化程度的人和小鼠細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、單生殖細(xì)胞、胚胎發(fā)育細(xì)胞等，還可以對(duì)高度分化的細(xì)胞(神經(jīng)、表皮等)進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序分析。

總之，第三代測(cè)序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)在：測(cè)序通量更高；測(cè)序成本更低；讀取長(zhǎng)度更長(zhǎng)；測(cè)序時(shí)間更短；所需起始用量更少；檢測(cè)精確性更高，即使變異極少也能檢出[52,53]。

1.3.3 不足

第三代測(cè)序技術(shù)適用于起始用量少、需要高通量、自動(dòng)化程度很高的全基因組測(cè)序，因此對(duì)于要求不高的單個(gè)基因位點(diǎn)的檢測(cè)如單基因病等的基因診斷反而不適用，即性價(jià)比反而降低。此外，第三代測(cè)序技術(shù)雖然已經(jīng)足夠先進(jìn)，但仍需要用到酶(聚合酶或核酸外切酶)，而如何保持酶的活性與穩(wěn)定性仍是一個(gè)重要的問(wèn)題；Helico Bioscience的 TSMS技術(shù)和Pacific Bioscience的SMRT技術(shù)都需要熒光標(biāo)記，怎樣提高單分子信號(hào)靈敏度同時(shí)又不能把信號(hào)變成噪音增加熒光背景也是一個(gè)需要解決的問(wèn)題；Oxford Nanopore技術(shù)雖無(wú)需標(biāo)記，但仍需要致力于背景噪音的減少和 DNA移動(dòng)速度的控制。另外，在DNA的固定方面如何保持DNA的延展性而不出現(xiàn)二聚體結(jié)構(gòu)，也是有待解決和完善的地方。

1.3.4 應(yīng)用

第三代測(cè)序技術(shù)由于具有測(cè)序通量更高，測(cè)序成本更低，讀取長(zhǎng)度更長(zhǎng)，測(cè)序時(shí)間更短，所需起始用量更少，檢測(cè)精確性更高，儀器和試劑相對(duì)便宜，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，并能準(zhǔn)確定量一個(gè)單細(xì)胞核中的基因拷貝數(shù)目等諸多優(yōu)勢(shì)，因而比NGS具有更廣闊的應(yīng)用空間。目前主要應(yīng)用在：?jiǎn)渭?xì)胞水平上變異信息的尋找、胚胎植入前的遺傳學(xué)診斷、單細(xì)胞水平上組織和細(xì)胞群異質(zhì)性的研究、腫瘤亞克隆演化的分析等方面[54,55]。其應(yīng)用范圍歸納起來(lái)包括：

(1) 基因組測(cè)序：相對(duì)NGS的優(yōu)勢(shì)就是能更快獲得結(jié)果，因此該系統(tǒng)在鑒定新的病原體和細(xì)菌的基因組測(cè)序方面得到廣泛的應(yīng)用；

(2) 甲基化研究：5 mC和5 hmC是甲基化研究中的熱點(diǎn)。但第一、第二代測(cè)序技術(shù)無(wú)法區(qū)分5 mC和5 hmC。美國(guó)芝加哥大學(xué)利用第三代測(cè)序技術(shù)和5 hmC選擇性化學(xué)標(biāo)記方法來(lái)檢測(cè)5 hmC，通過(guò)聚合酶動(dòng)力學(xué)提供的信息，可直接檢測(cè)DNA甲基化，為表觀遺傳學(xué)研究打開(kāi)了一條通路[56]；

(3) 突變鑒定(SNP檢測(cè))：?jiǎn)畏肿訙y(cè)序的分辨率具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)，而且沒(méi)有PCR擴(kuò)增步驟，也就沒(méi)有擴(kuò)增引入的堿基錯(cuò)誤，該優(yōu)勢(shì)使其在特定序列的SNP檢測(cè)，稀有突變及其頻率測(cè)定中大顯身手。研究人員用單分子測(cè)序技術(shù)重新證明了 FLT3基因是急性髓細(xì)胞白血病(AML)的有效治療靶標(biāo)，就是憑借PacBio平均3000 bp讀長(zhǎng)能獲得更多基因下游的寶貴信息，且能夠檢測(cè)低至1%頻率的罕見(jiàn)突變的技術(shù)優(yōu)勢(shì)[57]；

(4) RNA測(cè)序：根據(jù)第三代測(cè)序技術(shù)實(shí)時(shí)測(cè)序的特點(diǎn)，可以直接對(duì)RNA進(jìn)行測(cè)序，做到對(duì)特定組織和細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)差異的精確定位。而且還能檢測(cè)到微量的基因表達(dá)子或罕見(jiàn)的非編碼RNA[58]；

(5) 重復(fù)序列和 poly結(jié)構(gòu)的測(cè)序：第一代和第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)多達(dá)數(shù)百次的重復(fù)序列的測(cè)序都是無(wú)能為力或難以完成的，而用第三代測(cè)序技術(shù)則能很好勝任。如美國(guó)UC Davis醫(yī)學(xué)院利用PacBio技術(shù)環(huán)形比對(duì)測(cè)序模式，對(duì)FMR1中的CGG三核苷酸重復(fù)區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，獲得了超過(guò)10 kb的原始讀長(zhǎng)，即使是重復(fù)次數(shù)超過(guò) 750次的三核苷酸重復(fù)區(qū)域也能測(cè)出[59]；

(6) 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用：?jiǎn)畏肿訙y(cè)序技術(shù)由于能在短時(shí)間內(nèi)完成人體近30億個(gè)堿基對(duì)的測(cè)序，加上測(cè)序費(fèi)用明顯降低，故有望建立個(gè)人基因組信息檔案，這就意味著個(gè)體的生命信息將一目了然，今后的醫(yī)療將能以個(gè)人的基因組信息作為診斷、預(yù)防和治療的手段[60]，由此可見(jiàn)該技術(shù)將對(duì)個(gè)體醫(yī)學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生巨大的影響。如加拿大某癌癥研究所通過(guò)PacBio RS系統(tǒng)進(jìn)行臨床樣本癌基因及癌癥治療敏感/抗性相關(guān)遺傳標(biāo)記的測(cè)定，已有效制定針對(duì)該病人的治療方案[61]；

(7) 其他方面的應(yīng)用：讀長(zhǎng)長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)可用來(lái)填補(bǔ)測(cè)序數(shù)據(jù)拼接中Scaffolds之間的缺口；由于測(cè)序時(shí)對(duì)GC沒(méi)有偏好性，故可用于高 GC含量區(qū)域的測(cè)序，還能用于發(fā)夾結(jié)構(gòu)、莖環(huán)結(jié)構(gòu)等復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)序[56,62]。

在臨床診治特別是在癌癥研究方面，第三代測(cè)序技術(shù)近來(lái)年日益發(fā)揮著引領(lǐng)的作用，中國(guó)深圳華大基因研究院的研究人員做出了許多有目共睹的貢獻(xiàn)。例如：2012年，該院聯(lián)合國(guó)內(nèi)數(shù)所大學(xué)和醫(yī)院的研究人員對(duì)一例典型的、JAK2陰性的ET(原發(fā)性血小板增多癥，一種血癌)病人的 90個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行了全外顯子測(cè)序，將其中符合質(zhì)控的58個(gè)樣品用于群體分析，發(fā)現(xiàn)該ET病人為單克隆進(jìn)化，并發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)關(guān)鍵的 ET候選基因(SESN2和NTRK1等)可能參與 ET的發(fā)生、發(fā)展[63]。這一前沿研究為其他癌癥的研究奠定了良好的基礎(chǔ)，并可能因此而改變癌癥的治療策略。

腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)是腎癌中最常見(jiàn)的一種，在不同癌癥病人中很難找到共同突變。為了更好地理解ccRCC腫瘤內(nèi)部的基因組變化情況，華大基因研究院等數(shù)家單位的研究人員從ccRCC樣本中選取20個(gè)癌細(xì)胞和5個(gè)癌旁細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。通過(guò)聚類分析和進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)該例樣本為單克隆且此例腎癌并非由常見(jiàn)的兩個(gè)突變基因VHL和PBRM1所引起，說(shuō)明所鑒定的頻發(fā)突變(Recurrent mutation)可能與腫瘤個(gè)體無(wú)關(guān)。研究人員還對(duì)260個(gè)體細(xì)胞突變的位點(diǎn)進(jìn)行主成分分析(PCA)，從中又發(fā)現(xiàn)細(xì)胞RC15、RC17和RC20與癌旁組織聚集緊密，表明這些細(xì)胞應(yīng)為正常細(xì)胞而非腫瘤細(xì)胞，可見(jiàn)在癌癥分析和診斷過(guò)程中進(jìn)行個(gè)性化治療不但重要而且很有必要[64]。2014年，華大基因研究院又聯(lián)合香港中文大學(xué)、北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院/研究所對(duì)一例 T3N0M0結(jié)腸癌病人的63個(gè)腫瘤單細(xì)胞、4個(gè)正常單細(xì)胞樣本進(jìn)行外顯子組測(cè)序。通過(guò)單細(xì)胞群體遺傳學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞群存在著兩個(gè)克隆群體，且不同克隆具有不同的突變特征[65]。這些成果足以說(shuō)明第三代測(cè)序技術(shù)在癌癥診治等方面都具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，第一～三代測(cè)序技術(shù)特點(diǎn)的比較見(jiàn)表1。

2 基因診斷和測(cè)序技術(shù)的未來(lái)展望

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，隨著科研人員對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制研究的不斷深入，以及人類單倍型計(jì)劃、千人基因組計(jì)劃、癌癥基因組計(jì)劃、Meta-Hit計(jì)劃等重大國(guó)際合作項(xiàng)目的順利實(shí)施和相繼完成，人們?cè)絹?lái)越明了基因的突變/變異與疾病的發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在關(guān)系。因此，如何發(fā)展和利用基因檢測(cè)技術(shù)尋找致病基因、解碼個(gè)體基因、評(píng)估患病風(fēng)險(xiǎn)、改進(jìn)醫(yī)療模式，進(jìn)而對(duì)個(gè)體進(jìn)行基因診斷乃至基因治療將是未來(lái)遺傳病防治工作的發(fā)展趨勢(shì)。憑借人體基因密碼預(yù)測(cè)相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)性和發(fā)展進(jìn)程，做到早檢測(cè)、早預(yù)防、早治療，基因診斷技術(shù)在臨床的應(yīng)用將有更加廣闊的前景。展望未來(lái)，我們可以預(yù)見(jiàn)：

(1) 染色體水平與基因水平的檢測(cè)將結(jié)合得更加緊密，如染色體核型分析(G顯帶等)→光譜核型分析技術(shù)(SKY)→熒光原位雜交(FISH)→多色熒光原位雜交(M-FISH)→微陣列-比較基因組雜交技術(shù)(Array-CGH)→高精密的基因芯片→單基因的突變檢測(cè)和序列分析技術(shù)，等等；致病性突變與多態(tài)性變異將能快速檢出；遺傳標(biāo)記將揭示得更多、更全面；群體篩查的項(xiàng)目將日益增多。

(2) 每個(gè)人一生的生老病死有望在胚胎早期就被解讀、破譯，疾病的預(yù)防有望得到更早期、更有效的控制。遺傳病、腫瘤的防患可提前到婚檢階段；優(yōu)生、優(yōu)育將更好的結(jié)合；人類壽命、生活質(zhì)量有望得到進(jìn)一步延長(zhǎng)和提高；無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)檢將相當(dāng)普及，PGD也將進(jìn)入到一個(gè)更普及的階段，從而從根源上解決優(yōu)生的問(wèn)題；

表1 三代測(cè)序技術(shù)特點(diǎn)的比較[52,66,67]

(3) 隨著儀器成本的降低、小型化，試劑、試劑盒的大量研發(fā)，個(gè)體化、自主化檢測(cè)程度將更加提高；送檢樣品將更微量，一口唾液、一根毛發(fā)、一滴血等都能得到有效的檢測(cè)；隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)研究成果的不斷涌現(xiàn)，取樣將變得更簡(jiǎn)單、更多樣，尿液、汗液、唾液有望取代外周血用于分子診斷，可減輕患者抽血時(shí)的恐懼感；罕見(jiàn)病的診、防、治有望達(dá)到與常見(jiàn)病相同或相近的水平；基因檢測(cè)在療效評(píng)價(jià)和用藥指導(dǎo)方面，在個(gè)體識(shí)別、親子鑒定、法醫(yī)物證檢驗(yàn)等方面將發(fā)揮更加舉足輕重的作用；基因治療方面將找到更多新的治療靶點(diǎn)，從而促進(jìn)基因治療的迅猛發(fā)展。

(4) 測(cè)序技術(shù)從廣度、深度、速度、性價(jià)比、安全性、實(shí)用性、普及性等方面都將得到進(jìn)一步發(fā)展。從廣度、深度來(lái)講，未來(lái)測(cè)序技術(shù)有可能達(dá)到超高通量的水平，可進(jìn)行個(gè)體間的快速鑒別診斷甚至物種間的快速鑒定。從速度來(lái)講，未來(lái)測(cè)序技術(shù)所需的檢測(cè)時(shí)間將更短、達(dá)到超高速水平，比現(xiàn)在快出幾個(gè)數(shù)量級(jí)；成本將大大降低，性價(jià)比將大幅提升，到時(shí)測(cè)一個(gè)全基因組的價(jià)格也許有可能跟現(xiàn)在測(cè)一個(gè)基因的價(jià)格差不多；準(zhǔn)確性、安全性將明顯提高，誤診、漏診率將大大降低。未來(lái)的測(cè)序設(shè)備將更加小型化、微型化，就像電腦從立式到臺(tái)式到筆記本再到掌上電腦一樣，攜帶將更加方便，而功能將更加強(qiáng)大。所需的樣品將更少，種類將更多；高通量、自動(dòng)化、低成本獲得更大發(fā)展；在可預(yù)見(jiàn)的將來(lái)有望誕生第四代甚至第五代測(cè)序技術(shù)，屆時(shí)目前三代測(cè)序技術(shù)所存在的缺點(diǎn)和不足如依賴酶的活性、單分子信號(hào)靈敏度不夠高，背景噪音大、DNA移動(dòng)速度慢、DNA延展性不夠好等問(wèn)題都將得到很好的解決。

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