鄭影，欒德士，鄭洪亮，騰飛，王萍*

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040）

篤斯越橘(學(xué)名:Vaccinium uliginosum)也被稱為野生藍(lán)莓，為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium.spp)植物，為少見的真正藍(lán)色食物之一[1]。藍(lán)莓果是一種漿果，近似圓形，酸甜度適宜，是老少皆宜的水果。藍(lán)莓果實中含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、維生素A等，更重要的是富含葉酸、花色苷、類黃酮等化合物，不僅具有良好的營養(yǎng)保健功能，還具有防止腦神經(jīng)老化、強(qiáng)心、抗癌軟化血管、增強(qiáng)人機(jī)體免疫力等作用[2,3]。

花色苷是一種天然水溶性色素，極其不穩(wěn)定，易受到pH、溫度、光照、金屬離子及添加劑等因素的影響發(fā)生降解反應(yīng)[4,5]。隨著人們對食品營養(yǎng)要求的日益增強(qiáng)，藍(lán)莓鮮果及其加工品越來越受到人們的歡迎，其產(chǎn)品要經(jīng)過高溫殺菌來保證產(chǎn)品質(zhì)量，延長保質(zhì)期，可是這一操作對其中含有的花色苷物質(zhì)具有很大影響，使花色苷單體發(fā)生聚合，產(chǎn)生褐變，造成其質(zhì)量變差[6]。本課題通過采用不同的pH值下對篤斯越橘花色苷精制物進(jìn)行121℃高溫處理，一方面，測定處理后的花色苷殘留率及其中含有的4種存在形式花色苷含量，另一方面，采用兩個指標(biāo)測定處理液的抗氧化活性，通過分析其含量及抗氧化活性的變化，為藍(lán)莓花色苷工業(yè)化高溫處理及產(chǎn)品pH確定提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)莓凍果 大興安嶺生產(chǎn)；無水乙醇 天津市天力試劑有限公司；濃鹽酸、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鈉、乙醛、亞硫酸均為分析純 購自天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；DPPH· 購自美國Sigma公司；ABTS·+購自上海源葉生物科技有限公司。

SYQ-DSX-280B高溫殺菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；722型分光光度計 上海第三分析儀器廠；PHS-3C雷磁精密pH計 上海精密儀器有限公司；RT-6000酶標(biāo)分析儀 雷杜設(shè)備儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 篤斯越橘花色苷粗提物的制備

篤斯越橘凍果在室溫下進(jìn)行解凍，破碎，以60%乙醇為提取液，料液比為1：5，37℃水浴中提取1h，抽濾，真空濃縮。共提取三次，直至無顏色為止[7]。

1.2.2 篤斯越橘花色苷精制物制備

X-5大孔樹脂用乙醇浸泡24h，采用濕法上柱，活化備用?；ㄉ沾痔嵛镆砸欢魉偻ㄟ^層析柱，平衡吸附4h。用三倍柱體積的蒸餾水洗滌雜質(zhì)，用pH2.0的70%乙醇洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫液在40℃條件下減壓濃縮[8]。

1.2.3 篤斯越橘花色苷含量及殘留率的測定

采用pH示差法測定篤斯越橘花色苷含量[9,10]。不同pH溶液配制方法如下：

pH 1.0：0.2mol/L KCl：0.2mol/L HC1= 25：67, V /V

pH 4.5：0.2mol/L NaAc·3H2O：0.2mol/L HAc = 1：1, V/V

用移液管吸取2mL樣品液，分別用pH1.0和pH4.5的緩沖液稀釋至一定倍數(shù)混勻。以2mL溶劑代替樣品作空白組，分別在5l0nm和700nm處測定吸光值。

總花色苷的含量(以矢車菊色素-3-葡萄糖苷計)按下式計算：

A = [ (A510nm－A700nm)pH1.0－ (A510nm－A700nm)pH4.5]

ACY(mg/mL)=(A ×Mw×DF)/(26900 ×L)

其中：Mw —矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾分子質(zhì)量(449.2)；

DF —稀釋倍數(shù)；

26900 —矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)；

L —光程，1cm。

花色苷殘留率的計算公式如下：

花色苷殘留率(%)=[處理液中花色苷含量/處理前花色苷含量]×100

1.2.4 溫度為121℃、pH1-12對篤斯越橘花色苷精制物處理

pH2-12：采用B-R緩沖溶液(0.04mol/L的磷酸，0.04mol/L的乙酸，0.04mol/L的硼酸配制成的三酸混合液與0.2mol/L的NaOH溶液混合)，用pH計調(diào)至所需pH。

pH1：采用0.2mol/L KCl與0.2mol/L HC1以25：67(V/V)比例混合。

取適量的篤斯越橘花色苷精制物，用配制好的pH1-12的B-R緩沖液將其在25mL容量瓶中定容，使定容后的溶液花色苷濃度為0.1mg/mL，將容量瓶在121℃的高溫殺菌鍋中加熱6、8、10 min，取出后立即用流動自來水迅速冷卻，即得pH1-12的被處理液，做3組平行試驗。

1.2.5 花色苷處理液中4種存在形式花色苷含量測定

各花色苷含量測定用SO2和乙醛對花色苷存在形式的色度的影響。實驗中，40μL 10%乙醛加入到2mL的樣品中，之后靜止45min，另2 mL樣品中加入160μL 5% (w/v)SO2，在520 nm下測定吸光值。最后測定未加乙醛或是SO2的樣品在520 nm下的吸光值[11]。計算公式如下：

1.2.6 篤斯越橘花色苷處理液抗氧化活性測定

1.2.6.1 篤斯越橘花色苷處理液對DPPH·的清除能力的測定

試劑的配制：1×10-4mol/L DPPH·溶液：準(zhǔn)確稱取6mg DPPH·用95%的甲醇定容于100mL容量瓶中。

分別取濃度為1、2、6、12、16、20、25、30μg/mL的篤斯越橘花色苷處理液50 μL及250μL 2×l0-4mo1/L的DPPH溶液加入96孔板的同一孔中，避光放置30min，以各自的處理液作參比，分別測定517nm處的吸光度A1。同時測定50μL不同濃度提取液與250μL 95%甲醇混合30min后517nm處的吸光度A2，再測定250μL DPPH溶液與50μL 95%甲醇混合液517nm處的吸光度A3。根據(jù)公式計算其清除率[12,13]：

其中：A1----加測定溶液后DPPH·的吸光度；

A2----測定溶液在測定波長下的吸光度；

A3----未加測定溶液時DPPH·的吸光度。

1.2.6.2 篤斯越橘花色苷粗提物對ABTS·+清除能力的測定

配制ABTS·+工作液：準(zhǔn)確稱取0.0384gABTS·+試劑，定容至10mL；準(zhǔn)確稱取0.0134g過硫酸鉀試劑，定容至10mL。將以上兩試劑以1：1的比例混合，避光12h即得工作液(該工作液使用期限為3-4d[14]。

取適量ABTS·+工作液，以 PBS (100mmol/L，pH7.4)溶液將其稀釋，使稀釋液在414nm波長下吸光度為0.70±0.02。在96孔板的孔中依次加入50μL濃度為0.2、0.5、0.8、1.0、1.6、2.0、2.5μg/mL的花色苷處理液，然后加入300μL稀釋好的ABTS·+工作液，同時在另一組加入不同濃度樣液的孔中加入300μL B-R緩沖液，避光反應(yīng)6min，于414nm波長下測吸光值[15]。

其中：A1----加測定溶液后ABTS·+的吸光度；

A2----測定溶液在測定波長下的吸光度；

A3----未加測定溶液時ABTS·+的吸光度。

1.2.7 統(tǒng)計分析

采用Excel2003進(jìn)行繪圖，通過OriginPro 8.5.1進(jìn)行數(shù)據(jù)處理IC50值計算，并進(jìn)行相關(guān)結(jié)果比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 篤斯越橘花色苷處理液花色苷殘留率

采用pH示差法測定不同pH值、121℃處理藍(lán)莓花色苷不同時間后花色苷殘留率，結(jié)果如圖1所示：

圖1 不同pH值下藍(lán)莓花色苷處理液花色苷殘留率Fig. 1 Residual rate of anthocyanins in blueberry treatment solution with different pH

在 pH1.0-4.0時，藍(lán)莓花色苷雖降解了很多，但殘留率大約在 40.00%左右，花色苷在pH1.0-4.0的穩(wěn)定性幾乎一樣，pH值變化對其影響不顯著。pH5.0時花色苷較pH4.0時顯著下降，pH5.0-7.0內(nèi)花色苷的降解又趨于平緩，且這一范圍內(nèi)花色苷殘留率很低，說明花色苷在酸性偏接近中性時，穩(wěn)定性接近，但很不穩(wěn)定。在pH值為8.0時花色苷殘留率又有所升高，分析原因為在pH值8.0時有新的花色苷生成。pH8.0-12.0范圍內(nèi)，花色苷殘留率幾乎呈線性下降，花色苷極其不穩(wěn)定，在pH12.0時，121℃處理藍(lán)莓花色苷10min后花色苷殘留率僅為10.01%。

121℃處理藍(lán)莓花色苷時，處理時間對花色苷殘留率有很大影響。結(jié)果表明，處理時間越長，花色苷殘留率越低。同一pH值下，花色苷殘留率6min> 8min> 10min。

2.2 藍(lán)莓花色苷處理液4種存在形式花色苷含量

采用1.2.5中的方法對藍(lán)莓花色苷處理液中4種存在形式花色苷含量進(jìn)行測定。結(jié)果如圖2：

圖2 121℃加熱不同時間后處理液中4種存在形式花色苷含量Fig. 2 The contents of four forms of anthocyanins existing in solutions after heating at 121℃ for different time

不同 pH值下單體花色苷(MA)、輔色花色苷(SCA)、聚合花色苷(PA)和總花色苷(TA)含量變化大體都呈下降趨勢。TA在pH1.0-2.0時變化緩慢，在pH2.0-5.0時呈直線下降，說明花色苷在酸性條件下，隨著pH值的變大，花色苷穩(wěn)定性下降顯著。pH5.0-8.0內(nèi)，含量變化不明顯。pH11.0-12.0內(nèi)TA又有所上升，原因可能為在堿性條件下花色苷顏色深，已成深褐色，使測定結(jié)果產(chǎn)生很大誤差。

MA含量的變化趨勢與TA含量的基本一致，分析原因為其含量在TA含量中占了最大的比率，在pH5.0-7.0時，MA與PA含量接近相同，原因可能為微酸性條件下有利于花色苷的聚合。PA在pH1.0-3.0時含量最高，在pH4.0-12.0時含量變化平緩，得知在酸性條件下PA含量較高，但在微酸性及堿性條件下PA含量較低，且溶液酸堿性對其影響很小。SCA在pH4.0-5.0時有微量的存在，在其它 pH值下幾乎不存在，原因可能為提取原料為藍(lán)莓凍果，且經(jīng)過了大孔樹脂純化處理，其中所含有的金屬離子、糖、有機(jī)酸等大分子很少，對其輔色作用的促進(jìn)很弱。

2.3 藍(lán)莓花色苷處理液體外抗氧化實驗結(jié)果

2.3.1 藍(lán)莓花色苷處理液對DPPH·的清除能力的測定結(jié)果

2.3.1.1 不同pH對高溫處理的藍(lán)莓花色苷處理液的DPPH·清除能力的影響

不同pH條件下，處理液的DPPH·清除能力的結(jié)果如圖3所示：

圖3 不同pH、濃度的藍(lán)莓花色苷處理液的DPPH·的清除率Fig. 3 The clearance rate of DPPH· of blueberry in different pH and concentration

經(jīng)121℃處理6min后，處理液對DPPH·清除能力隨花色苷濃度的升高而增強(qiáng)。pH1-6時，清除率在花色苷濃度為25μg/mL時趨于平緩，pH7.0時，清除率直線上升，曲線無平緩趨勢。pH1.0-4.0時，花色苷對DPPH·的清除率在同一濃度時非常接近，pH7.0、同一花色苷濃度下，花色苷對DPPH·的清除率比在pH1.0-6.0時低很多。

2.3.1.2 pH對不同加熱時間的藍(lán)莓花色苷精制物處理液的DPPH·的清除的IC50值比較

將藍(lán)莓花色苷精制物用pH1.0-7.0緩沖液稀釋定容后，分別經(jīng)121℃加熱6、8、10min，測定處理液對DPPH·的清除能力，將其對DPPH·清除率的IC50值作比較，結(jié)果如圖4所示：

圖4 不同加熱時間、pH下藍(lán)莓花色苷處理液DPPH·清除率的IC50值Fig. 4 The values of IC50 of blueberry in different heating time and pH

隨pH值升高，花色苷處理液對DPPH·清除能力逐漸降低，水溶液接近中性時，清除能力下降的最快。pH1.0-3.0時，121℃加熱處理6min下的處理液對DPPH·清除能力最強(qiáng)，而加熱處理8、10min下處理液對DPPH·清除能力較接近，說明在強(qiáng)酸性條件下，121℃加熱處理時間超過6min后，加熱時間對其對DPPH·清除能力影響較小，pH值對其影響占主導(dǎo)作用。pH4.0-6.0時，處理液對DPPH·清除能力隨著加熱時間增加而降低，其IC50值6min<8min<10min，說明在此pH區(qū)間內(nèi)，加熱時間、pH值對其對DPPH·清除能力產(chǎn)生影響。處理液對DPPH·清除能力在121℃加熱處理 6min、pH1.0時達(dá)到最強(qiáng)，花色苷濃度為 35μg/mL時達(dá)到 90%，IC50值為1.496μg/mL。

2.3.2 藍(lán)莓花色苷處理液對ABTS·+的清除能力的測定結(jié)果

2.3.2.1 不同pH對高溫處理的藍(lán)莓花色苷處理液的ABTS·+清除能力的影響

不同pH條件下，處理液的ABTS·+清除能力的結(jié)果如圖5所示：

圖5 不同pH、濃度的藍(lán)莓花色苷處理液的ABTS·+的清除率Fig. 5 The clearance rate of ABTS·+ of blueberry in different pH and concentration

pH1.0-4.0下，處理液對 ABTS·+清除能力在同一花色苷濃度下很接近，分析原因為強(qiáng)酸性條件下，pH值變化對其影響較小。酸性及中性條件下，花色苷濃度達(dá)到一定濃度后，其對ABTS·+清除率曲線趨于平緩；在堿性條件下，藍(lán)莓花色苷精制物對ABTS·+清除率隨著花色苷濃度的升高而增大，曲線無平緩趨勢。

2.3.2.2 pH對不同加熱時間的藍(lán)莓花色苷精制物處理液的ABTS·+的清除的IC50值比較

藍(lán)莓花色苷精制物用pH1.0-12.0緩沖液稀釋定容后，分別經(jīng)121℃處理6、8、10min，測定處理液對ABTS·+清除能力。將其對ABTS·+清除率的IC50值作比較，結(jié)果如圖6所示：

圖6 不同加熱時間、pH下藍(lán)莓花色苷處理液ABTS·+清除率的IC50值Fig. 6 The values of IC50 of blueberry in different heating time and pH

pH1.0-4.0時加熱時間對處理液的ABTS·+清除能力影響很小，尤其是在pH1.0時最為明顯；pH5.0時，加熱時間對處理液的ABTS·+清除能力影響較明顯，清除能力為6min>8min>10min；堿性條件下，加熱時間對處理液的ABTS·+清除能力影響明顯，且pH值越大，影響越顯著。

3 結(jié)論

高溫處理及 pH值對篤斯越橘花色苷精制物影響很大，隨著加熱時間延長，其受到破壞程度變大。在強(qiáng)酸性下花色苷穩(wěn)定性強(qiáng)，pH2.0時，121℃加熱6、8、10min時花色苷殘留率下降率依次為2.01%、1.31%，加熱6min時的花色苷殘留率是8、10min時的1.02、1.03倍，堿性條件下的殘留率直線下降；花色苷處理液中單體花色苷含量最高，變化趨勢與總花色苷近似，酸性條件下的PA含量較高，微酸性及堿性條件下的PA含量較低，輔色花色苷僅在pH4.0-5.0時有微量的存在，在其它 pH值下幾乎不存在；加熱處理使花色苷的抗氧化活性大大降低，且隨著pH值的增大而降低的更明顯。故工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)盡量使花色苷溶液在pH2.0左右強(qiáng)酸性范圍內(nèi)，若為保證產(chǎn)品質(zhì)量防止產(chǎn)品在銷售放置過程中因存在雜菌而出現(xiàn)質(zhì)量問題，可以適當(dāng)增加高溫殺菌時間。

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