涂鴻盛， 范 軍*， 譚 藝， 林 純， 華江穎， 章偉光，*

(1.華南師范大學化學與環(huán)境學院，廣東廣州510006;2.廣州研創(chuàng)生物技術發(fā)展有限公司，廣東廣州510663)

手性固定相-高效液相色譜(HPLC)直接拆分對映異構體技術是當今手性樣品分離和分析的重要手段之一［1，2］。理想的手性固定相應具有較好的手性識別能力和較高的對映體選擇性，能適用于多種結構類型的對映體分離［3］。其中，基于纖維素-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)和直鏈淀粉-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)等的涂覆型手性固定相(如Chiralcel OD和Chiralpak AD)已成功用于多種手性化合物的拆分［4，5］。但涂覆型手性固定相不耐高壓，且溶劑耐受性差，在一些非常規(guī)流動相溶劑(如四氫呋喃、氯仿、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯等)中，涂覆在硅膠表面的多糖衍生物會溶脹，甚至溶解，手性柱的分離性能驟降［3］。為了拓展多糖衍生物手性固定相的應用范圍，Okamoto 等［6－8］、Kimata等［9］和 Francotte［10］分別研發(fā)了鍵合型多糖手性固定相的制備。與傳統(tǒng)的涂覆型手性固定相材料相比，鍵合型手性固定相中手性選擇劑與硅膠基質間通過化學鍵結合，化學穩(wěn)定性顯著提高，溶劑耐受性更好，流動相和樣品溶劑的選擇更多。目前已有公司相繼推出了一系列鍵合型多糖手性柱產品，如Chiralpak IA-IF［11，12］。

與通過二異氰酸酯與硅膠鍵合的方法［6］、自由基共聚反應法［9］和光化學合成法［10］等相比，施陶丁格(Staudinger)反應法［13－15］具有條件溫和、過程易控制和重現性好的特點。Zhang等［16］利用該方法制備了鍵合6-疊氮-6-脫氧纖維素-苯基氨基甲酸酯的手性固定相。本課題組也曾制備了以6-疊氮-6-脫氧纖維素(或直鏈淀粉)-3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯為手性選擇劑的鍵合型多糖手性固定相［17，18］。本研究采用施陶丁格反應將6-疊氮-6-脫氧纖維素-3，5-二氯苯基氨基甲酸酯鍵合到氨丙基硅膠上，得到了一種新的鍵合型手性固定相(命名為ImCel)，并研究了其手性分離性能，探討了非常規(guī)流動相溶劑與糖單元上取代基對固定相分離性能的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津SPD-15C高效液相色譜系統(tǒng)，配有紫外檢測器、帶20 μL定量環(huán)的7725i進樣器和N2000工作站(日本島津公司);Spectrum One紅外光譜儀、TGA7熱分析儀、2400 CHN元素分析儀(美國Perkin-Elmer公司)。

微晶纖維素(分析純，上海國藥化學試劑有限公司);裸硅膠(5 μm，30 nm，日本Fuji Silysia化學有限公司);3，5-二氯苯異氰酸酯(濮陽市宏大圣導新材料有限公司);正己烷、異丙醇、乙醇(色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司)，三氟乙酸、二乙胺(色譜純，上海晶純生化科技股份有限公司);其他試劑均為國產分析純。在固定相合成實驗中，吡啶、甲苯、四氫呋喃用標準方法脫水干燥后使用。20種手性化合物樣品結構式如圖1所示，由廣州研創(chuàng)生物技術發(fā)展有限公司提供。

1.2 ImCel的制備

ImCel的合成路線如圖2所示。參考文獻［18］方法得到6-疊氮-6-脫氧纖維素(Ⅰ)。將化合物Ⅰ(1.00 g)均勻分散在90 mL無水吡啶中，加入過量的3，5-二氯苯異氰酸酯(7.00 g，為纖維素上羥基物質的量的2倍用量)，100℃下反應48 h。蒸除吡啶后加入甲醇，析出固體，得到6-疊氮-6-脫氧纖維素-3，5-二氯苯基氨基甲酸酯(Ⅱ)。參考文獻［13，14］方法制備氨丙基硅膠。在氨丙基硅膠(4.00 g)上均勻涂敷化合物Ⅱ(1.00 g)，然后超聲分散于30 mL甲苯中。逐滴加入15 mL含三苯基膦(Ph3P，2.00 g)的甲苯溶液，CO2環(huán)境下過夜反應。過濾，依次用丙酮和四氫呋喃洗滌，最后真空干燥過夜得到目標產物ImCel。

1.3 色譜柱填裝

將ImCel均勻分散于正己烷-異丙醇溶液(80∶20，v/v)中，以正己烷-異丙醇溶液(90∶10，v/v)為頂替液，在45 MPa壓力下采用勻漿法將其裝入不銹鋼柱管(150 mm×4.6 mm)中。

1.4 色譜條件和計算

液相色譜分離實驗在室溫下進行。樣品用乙醇溶解，流動相使用前經過濾及超聲脫氣處理。檢測波長為254 nm，未注明時流動相的流速為1.0 mL/min。

保留因子k=(tR－t0)/t0，其中tR為樣品在柱上的保留時間，t0為死時間。分離因子α=k2/k1，其中k1和k2分別為第1個和第2個洗脫對映異構體的保留因子。分離度Rs=2(tR2－tR1)/(w2+w1)，其中tR1和tR2分別為第1個和第2個洗脫對映異構體的保留時間，w1和w2分別為相應對映異構體色譜峰的半峰寬［13，14］。

2 結果與討論

2.1 手性選擇劑及手性固定相的表征

圖1 20種手性化合物的結構示意圖Fig.1 Structures of 20 chiral compounds

圖2 ImCel的合成路線圖Fig.2 Synthetic route of the ImCel

對實驗中制備的手性選擇劑(化合物Ⅱ)和手性固定相材料進行紅外光譜表征。在化合物Ⅱ中，3 350 cm－1附近O－H伸縮振動峰的強度變弱，在3 319 cm－1處出現 N－H的特征吸收峰，在2 112 cm－1處出現N3的特征吸收峰，在1 735 cm－1處出現C=O的特征吸收峰。在ImCel的紅外光譜中，2 100 cm－1附近的吸收峰消失，1 038 cm－1處出現Si－O－Si的特征吸收峰，纖維素單元上的其他特征吸收帶(C=O和N－H)仍可觀察到。

對氨丙基硅膠、化合物Ⅱ及手性固定相分別進行了元素分析?；衔铫虻慕Y果為:C 67.34%、H 6.58%、N 1.01%;ImCel的結果為:C 7.24%、H 0.98%、N 1.05%。與氨丙基硅膠的元素分析結果(C 4.19%、H 0.81%、N 2.73%)相比，在制備得到的手性固定相中，碳含量明顯增加。另一方面，由熱重分析結果可知，從室溫到800℃范圍內，ImCel的失重百分數為20.54%，氨丙基硅膠在相同溫度范圍內的失重百分數為5.57%。這些結果都表明，在發(fā)生施陶丁格反應后，手性選擇劑(即化合物Ⅱ)被有效結合到硅膠表面。

2.2 ImCel的分離性能

研究了ImCel對20種手性化合物的分離性能，分析結果見表1。其中17對手性化合物得到了基線分離(分離度Rs≥1.5)。在流動相的選擇上，除樣品6和18外，其余15種樣品在正己烷-醇的流動相條件下均可實現基線分離。此外，ImCel在反相條件下也具有較好的手性分離性能［11，19，20］，如樣品2在流速為0.7 mL/min的甲醇-醋酸/三乙胺緩沖溶液(0.1%，v/v，pH 4.8)(70∶30，v/v)條件下的Rs為1.89，α為1.36;樣品6在流速為0.7 mL/min的乙腈-醋酸/三乙胺緩沖溶液(0.1%，v/v，pH 5.4)(70∶30，v/v)條件下的 Rs為1.80，α 為1.32;樣品19在流速為0.7 mL/min的甲醇-水-三氟乙酸(75∶25∶0.1，v/v/v)條件下的 Rs為 2.22，α 為1.48。對比可知，ImCel在正相條件下的分離性能優(yōu)于其在反相條件下的分離性能，所以后續(xù)工作主要在正相條件下進行。

多糖衍生物手性固定相對手性分子的識別關鍵在于固定相與底物分子間的相互作用(如氫鍵、偶極-偶極相互作用、π－π作用等)和多糖自身高度有序的結構［20］。ImCel上同時有脲鍵、酯基和芳環(huán)等官能團，極性的苯氨基甲酸酯基能夠圍繞纖維素主鏈形成螺旋溝槽［20］;而拉唑類化合物(樣品1～5)中同樣含有O、N等原子及芳環(huán)，易與手性固定相發(fā)生相互作用，從而得到良好的拆分。拉唑類化合物樣品的Rs均在3.0以上(見表1)。

表1 ImCel對20種手性化合物的HPLC拆分條件與分離結果Table 1 Conditions and the separation performances on ImCel for 20 chiral compoundsby HPLC under optimized conditions

2.3 非常規(guī)流動相溶劑對ImCel分離性能的影響

與涂覆型手性固定相相比，鍵合型多糖手性固定相對溶劑耐受性好，適用于更多的流動相體系［11，12，20］。在本研究中，以 Hex-EtOH-TFA(80∶20∶0.1，v/v/v)和 Hex-IPA(80∶20，v/v)為基礎，以10%(v/v)的非常規(guī)流動相溶劑(如氯仿、四氫呋喃和乙酸乙酯等)替代10%(v/v)的醇得到新的流動相，分別考察ImCel在新流動相條件下對樣品10～20的分離情況。結果表明，相對于丙酮、四氫呋喃、乙酸乙酯和二氯甲烷等溶劑，在流動相中加入氯仿可明顯提高ImCel對手性樣品的分離能力。因此，本研究主要考察添加氯仿對固定相手性識別能力的影響。

如表2所示，添加非常規(guī)流動相溶劑后，ImCel對樣品10、11、14和18的分離能力明顯增強。在流動相Hex-IPA(80∶20，v/v)中，樣品10的兩種對映體同時被洗脫，無法得到拆分;添加10%THF后，樣品10在 ImCel上的保留增強，分離度增大到0.73(見圖3a)。樣品18在Hex-EtOH-TFA(80∶20∶0.1，v/v/v)的流動相中分離度僅為0.69，添加氯仿后，分離度增大到1.56(見圖3b)。此外，添加氯仿對這些樣品分離的影響不完全相同，除樣品17外，其余樣品的分離因子都增大，但分離度的變化趨勢略有不同。

表2 非常規(guī)流動相溶劑對ImCel分離性能的影響Table 2 Effects of non-standard solvents on the separation performance of the ImCel

圖3 樣品10和18在不同流動相中的分離色譜圖Fig.3 Chromatograms of samples 10 and 18 under different mobile phase conditionsMobile phases:a.Hex-IPA(80∶20，v/v);b.Hex-IPA-THF(80∶10∶10，v/v/v);c.Hex-EtOH-TFA(80∶20∶0.1，v/v/v);d.Hex-EtOH-CHCl3-TFA(80∶10∶10∶0.1，v/v/v/v).

2.4 糖單元上取代基對固定相分離性能的影響

此前，本實驗室報道了一種以6-疊氮-6-脫氧纖維素-(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)為手性選擇劑的鍵合型手性固定相(命名為RC-IB)［18］。RC-IB和ImCel都以纖維素為原料，通過施陶丁格反應將手性選擇劑鍵合到硅膠上;不同的是，RC-IB苯環(huán)上的3，5-位氫原子被甲基取代，而ImCel苯環(huán)上的3，5-位氫原子被氯原子取代。在流動相為 Hex-EtOH-TFA(90∶10∶0.1，v/v/v)的條件下，研究這兩種固定相對一系列芴甲氧羰基(fmoc)-氨基酸衍生物(12～20)分離性能的差異，以探討纖維素糖單元上取代基團對分離性能的影響，結果如表3所示。

表3 樣品12～20在ImCel和R C-IB上的拆分結果Table 3 Chromatographic data for samples 12－20 on ImCel and R C-IB

從樣品的保留情況分析，除樣品18外，其余樣品在RC-IB上的保留因子都比在ImCel上的大，說明樣品在RC-IB上的保留較強。從拆分結果分析，RC-IB對樣品12、14和18表現出良好的識別能力，相應的分離度和分離因子都優(yōu)于ImCel柱，但對樣品15、17和19無分離趨勢。ImCel對這一系列fmoc-氨基酸衍生物都表現出良好的識別能力，其中對樣品13、15～17、19和20的拆分性能明顯優(yōu)于RC-IB。

雖然兩種手性固定相的骨架結構、基質材料、鍵合方式相同，衍生官能團(即苯氨基甲酸酯)相似，與底物分子間形成的相互作用力(如氫鍵、偶極-偶極相互作用和π－π作用等)相似，但苯環(huán)上的取代基會影響芳環(huán)及相鄰官能團的電荷密度，從而影響固定相與底物間的相互作用，進而影響其手性拆分性能。對于RC-IB，甲基的存在使苯環(huán)的π-電子密度增大，易與顯π-酸性的底物分子產生π－π作用;對于ImCel，氯原子的吸電子效應引起苯環(huán)的π-電子密度降低，對鄰近酰胺基的N－H鍵產生遠程吸引作用，使得氫原子的電子密度降低，從而易與底物中的氫鍵給體產生氫鍵相互作用。這些相互作用都加強了固定相對手性底物的拆分性能［21］，因此，Im-Cel和RC-IB間表現出一定的互補性。

由表3和圖4可以看出，除樣品18外，其余化合物在兩種固定相上的洗脫順序恰好相反，比如樣品12和13的L型對映體在ImCel上的保留較弱，先于D型對映體被洗脫;而對于RC-IB，D型對映體則先于L型對映體被洗脫。對映體洗脫反轉是高效液相色譜手性分離中一個非常有趣的現象，盡管文獻報道改變手性選擇劑的種類及固定方式［21］、柱溫［22］、流動相的 pH 值［23，24］、有機添加劑的種類和比例［23，24］等條件可能引起對映體洗脫反轉，但實際并不多見，目前對對映體洗脫反轉現象尚難以解釋和預測。

圖4 ImCel和R C-IB對樣品12和13的分離色譜圖Fig.4 Chromatograms of samples 12 and 13 separated on ImCel and R C-IB，respectivelyMobile phase:Hex-EtOH-TFA(90∶10∶0.1，v/v/v).

3 結論

采用施陶丁格反應得到了一種新的鍵合型纖維素手性固定相ImCel，研究了其對20種手性化合物的拆分性能，討論了添加非常規(guī)流動相溶劑對固定相分離性能的影響，研究了ImCel和RC-IB對一系列fmoc-氨基酸衍生物的分離性能差異，探討了引起這些差異的原因。結果表明，ImCel對所選的手性化合物表現出了良好的分離性能，且添加非常規(guī)流動相溶劑可改善其對底物的識別能力。ImCel和RC-IB對一系列fmoc-氨基酸樣品的分離具有互補性，并發(fā)現了手性固定相引起的對映體洗脫反轉現象。

［1］ Jin Z L，Hu F F，Wang Y B，et al.Chinese Journal of Chromatography(金召磊，胡芳芳，汪一波，等.色譜)，2011，29(11):1087

［2］ He X M，Yao Y Y，Ndorbor T，et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry(何小梅，姚譽陽，Ndorbor Theophilus，等.分析化學)，2013，41(8):1188

［3］ Ikai T，Okamoto Y.Chem Rev，2009，109(11):6077

［4］ Zhang C，Jin L X，Zhou S S，et al.Chirality，2011，23(3):215

［5］ Zhang K，Xue N，Li L，et al.Chinese Journal of Chromatography(張愷，薛娜，李林，等.色譜)，2010，28(2):215

［6］ Okamoto Y，Aburatani R，Miura S，et al.J Liq Chromatogr，1987，10(8):1613

［7］ Enomoto N，Furukawa S，Ogasawara Y，et al.Anal Chem，1996，68(17):2798

［8］ Kubota T，Kusano T，Yamanoto C，et al.Chem Lett，2001，30(7):724

［9］ Kimata K，Tsuboi R，Hosoya K，et al.Anal Methods Instrum，1993，1(1):23

［10］ Francotte E R.J Chromatogr A，2001，906(1/2):379

［11］ Zhang T，Franco P，Nguyen D，et al.J Chromatogr A，2012，1269:178

［12］ Huang H，Jin J Y，Lee W J.Chinese Journal of Chromatography(黃虎，金京玉，李元宰.色譜)，2009，27(4):467

［13］ Lin C，Liu W N，Fan J，et al.J Chromatogr A，2013，1283:68

［14］ Zhang Z B，Zhang W G，Luo W J，et al.J Chromatogr A，2008，1213(2):162

［15］ Zhang L F，Wong Y C，Chen L，et al.Tetrahedron Lett，1999，40(9):1815

［16］ Zhang S，Ong T T，Ng S C.Tetrahedron Lett，2007，48(31):5487

［17］ Peng G M，Wu S Q，Fang Z L，et al.J Chromatogr Sci，2012，50(6):516

［18］ Tan Y，Fan J，Lin C，et al.J Sep Sci，2014，37(5):488

［19］ Xu X F，Guo Z M，Liang X M.Chinese Journal of Chromatography(徐雪峰，郭志謀，梁鑫淼.色譜)，2012，30(11):1188

［20］ Chankvetadze B.J Chromatogr A，2012，1269:26

［21］ Chankvetadze L，Ghibradze N，Karchkhadze M，et al.J Chromatogr A，2011，1218(37):6554

［22］ Yao B X，Zhan F P，Yu G Y，et al.J Chromatogr A，2009，1216(28):5429

［23］ Wang T，Wenslow R M Jr.J Chromatogr A，2003，1015(1/2):99

［24］ Wang Q Y，Xiong Y Y，Lu B Z，et al.J Sep Sci，2013，36(8):1343