張秀堯， 蔡欣欣， 張曉藝

（溫州市疾病預防控制中心，浙江 溫州325001）

α－龍葵堿（又名茄堿，α－solanine）和α－卡茄堿（α－chaconine）同屬甾族生物堿的甙類化合物，為馬鈴薯生物堿的主要成分，約占塊莖總生物堿的95%。茄啶（solanidine）為其甙元，在馬鈴薯中含量較低，又為α－龍葵堿和α－卡茄堿在人體內的代謝產(chǎn)物。這3種化合物的結構式見圖1。新鮮馬鈴薯塊莖的生物堿含量較低，約為20～100 mg／kg，目前認為含量在200 mg／kg 以下時可以安全食用［1］。如果馬鈴薯生長、采收和儲藏條件不利會造成其生物堿含量增高。如光線照射、溫度過高或機械性損傷都會造成生物堿含量增高，尤其在發(fā)芽后，幼芽和芽眼部分的生物堿含量更高，誤食常會引起中毒。馬鈴薯總生物堿的人中毒劑量約為2 mg／kg 體重，3～6 mg／kg體重的劑量可能會危及生命。α－龍葵堿和α－卡茄堿是膽堿酯酶抑制劑，中毒初期會破壞胃腸道細胞產(chǎn)生腸胃炎，表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉和腹痛等，引起出汗、嘔吐、腹瀉和支氣管痙攣等癥狀，嚴重者意識喪失、呼吸麻痹或心力衰竭而死亡。α－龍葵堿、α－卡茄堿和茄啶不溶于水，不被水煮、烘焙、微波等烹調方法破壞，只有油炸才能顯著去除［2－4］。

馬鈴薯生物堿的檢測方法有液相色譜－紫外檢測法［5－6］、氣相色譜－質譜聯(lián)用法［7］、基質輔助激光解吸電離－飛行時間質譜法（MALDI－TOF／MS）［8］、酶聯(lián)免疫分析［9］、液相色譜－質譜聯(lián)用法［10－14］等，以上方法多用于馬鈴薯樣品的檢測。對于生物體液樣品，文獻［15］報道的α－龍葵堿、α－卡茄堿和茄啶的檢測方法為液相色譜法用于測定血清樣品。由于待測物不含發(fā)色團，只能在低波長紫外檢測，靈敏度低且干擾嚴重；血清樣品需經(jīng)固相萃取、離線氰丙基液相色譜富集和純化，然后再經(jīng)硅膠柱液相色譜分離于200 nm紫外檢測，檢出限為0.3 ng／mL，但操作煩瑣，檢測周期長，4天時間才能完成20份樣品的檢測。

目前生物樣品中痕量有毒有害物質的確證檢測首推液相色譜－三重四極桿質譜聯(lián)用法［16－18］。本文對實驗條件進行優(yōu)化，建立了血漿和尿液中3種馬鈴薯生物堿的超高效液相色譜－串聯(lián)質譜（UPLCMS／MS）測定方法，用于馬鈴薯中毒的快速檢測。

圖1 α－龍葵堿、α－卡茄堿和茄啶的化學結構Fig.1 Chemical structures ofα－solanine，α－chaconine and solanidine

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Acquity UPLC－Quattro Premier XE超高效液相色譜－串聯(lián)質譜儀，配有電噴霧源、Masslynx 4.1工作站（美國 Waters公司）；ASPEC XL4 4通道全自動固相萃取儀（法國Gilson公司）；MS3旋渦混旋器（德國IKA公司）；N－EVAP氮吹儀（12孔，美國 Organomation公司）；Gradient A10 Milli－Q 超純水器（Millipore公司）。

乙腈和甲醇（HPLC級，德國 Merck公司），甲酸（HPLC級，美國Tedia公司）；MCX固相萃取柱（30 mg／1 mL，美國 Waters公司）；α－龍葵堿和α－卡茄堿標準物質（美國Sigma公司），茄啶由發(fā)芽馬鈴薯提取的總生物堿經(jīng)2 mol／L HCl 100℃水解3 h后再純化制得，分別溶于甲醇配制成1.0 mg／mL標準貯備溶液（茄啶先溶于少量吡啶）；血漿來自溫州市中心血站；尿液由健康人志愿者提供。

1.2 色譜條件

Acquity UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7μm，Waters公司），VanGuard BEH C18保護柱（5 mm×2.1 mm，1.7μm，Waters公司）；流動相A為0.1%（如無特殊說明均為體積分數(shù)）甲酸乙腈溶液，流動相B為含0.05%甲酸的5 mmol／L 乙酸銨水溶液。梯度洗脫程序：0～1.50 min，25%A～40%A；1.50～2.50 min，40%A～55%A；2.50～2.60 min，55%A～95%A；2.60～4.00 min，95%A；4.00～4.10 min，95%A～25%A；4.10 ～ 5.50 min，25%A。 流 速：0.300 mL／min；柱溫：45℃；進樣體積：10μL。

1.3 質譜條件

采用ESI正離子MRM模式。ESI毛細管電壓：3.0 kV；離子源溫度：120℃；錐孔反吹氣流量：50 L／h，脫溶劑溫度：380 ℃，脫溶劑氣流量：500 L／h，碰撞室氬氣壓力：0.352 Pa。其他參數(shù)見表1。

運行開始時，色譜柱流出液經(jīng)6通切換閥切換至廢液中直到1.20 min，質譜開始采集數(shù)據(jù)直到2.5 min結束，同時6通切換閥又將柱流出液切換至廢液中。

表1 3種馬鈴薯生物堿的多反應監(jiān)測參數(shù)Table 1 MRM parameters for the three glycoalkaloids

1.4 樣品前處理方法

取250μL血漿或尿液樣品加入250μL 2%甲酸水溶液，旋渦混勻，置于自動固相萃取儀的樣品架中。MCX固相萃取柱依次用1.0 mL甲醇和1.0 mL水活化；以1.0 mL／min流速上樣500μL樣品溶液；分別用1.0 mL的2%甲酸水溶液和1.0 mL的甲醇淋洗（3.0 mL／min），抽干；3 mL含5%氨水的乙腈－甲醇溶液（6∶4）洗脫（2.0 mL／min）；洗脫液于55℃以氮氣吹干，溶于500μL20%甲醇水溶液；過0.2μm濾膜，待測。

2 結果與討論

2.1 質譜和色譜條件的優(yōu)化

在電噴霧正離子檢測方式下對質譜測定條件進行優(yōu)化。先進行一級質譜分析（Q1掃描），得到3種待測物的準分子離子峰［M＋H］＋；然后對每種準分子離子峰進行二級質譜分析（子離子掃描），得到碎片離子信息，再對錐孔電壓，碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化。遵循國際慣例，確證分析需要4個識別點［19］，要求選擇2對分子離子對。α－龍葵堿和α－卡茄堿的子離子碎片較多，可以選擇2對離子強度最高的分子離子對，而茄啶只有1個子離子碎片（m／z 98.1），故只能選用1對分子離子對。設定合適的峰駐留時間確保色譜峰的采樣點數(shù)為15～20點，從而得到較好的定量重復性。

采用 UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7μm）對流動相條件進行優(yōu)化，結果發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸乙腈溶液和含0.05%甲酸的5 mmol／L乙酸銨溶液作為流動相時，3種待測物的MRM響應最強，且峰形較好（見圖2）。由于α－龍葵堿和α－卡茄堿具有相同的甙元，均含有3個單糖，分子結構非常相似，C18柱無法分離?？紤]到α－龍葵堿和α－卡茄堿的定量離子對都具有相同的子離子（m／z 98.2），可能會存在質譜通道間子離子的交叉干擾（cross－talk）。因此在本實驗條件下單獨進樣α－龍葵堿或α－卡茄堿，結果均未檢出α－卡茄堿或α－龍葵堿，說明α－龍葵堿和α－卡茄堿雖然在色譜上沒有分離開，但并不相互干擾。

2.2 樣品前處理方法的選擇

關于生物體液中的馬鈴薯生物堿測定的前處理，Hellenas等［15］采用Bond Elut C2固相萃取柱處理血清樣品，屬反相機理，再經(jīng)氰基柱液相色譜富集和純化，操作煩瑣，前處理周期長。α－龍葵堿、α－卡茄堿和茄啶為堿性化合物，適合用MCX固相萃取柱進行樣品前處理。樣品酸化后生物堿帶正電，可以被MCX固相萃取柱保留，經(jīng)2%甲酸水溶液和甲醇淋洗去除雜質，最終用含5%氨水的乙腈－甲醇溶液（6∶4）洗脫。與用20%甲醇水溶液配制成的標準溶液相比較，尿液中α－龍葵堿、α－卡茄堿和茄啶的基質效應分別為122%、115%和124%，提取回收率分別為92%、95%和78%；血漿中基質效應分別為121%、120%和122%，提取回收率分別為88%、84%和76%。由于缺少同位素內標，本方法采用基質加標外標法定量，可抵消基質增強效應，方法簡單、快速。

圖2 空白血漿加標樣品的MRM色譜圖（10 ng／mL）Fig.2 MRM chromatograms of spiked blank plasma samples（10 ng／mL）

2.3 方法的線性范圍和檢出限

在空白樣品中，加入適量標準溶液制作系列（6點）基質加標溶液，進行樣品前處理，然后在選定的色譜和質譜條件下進行測定，基質空白均無干擾。采用Masslynx 4.1中Targetlynx組件，以定量離子對的峰面積對基質加標質量濃度進行回歸（權重取1／x），血 漿 和 尿 液 中 3 種 待 測 物 在 0.3～100 ng／mL 范圍相關系數(shù)均為0.997～0.999，符合線性關系的要求。在空白樣品中添加低濃度的系列標準溶液，進行樣品前處理后上機測定。α－龍葵堿和α－卡茄堿以2對分子離子對3倍信噪比的響應值對應的樣品質量濃度作為檢出限（LOD），茄啶以定量分子離子對3倍信噪比的響應值對應的樣品質量濃度作為檢出限（LOD），以10倍信噪比作為定量限（LOQ）。結果表明血漿和尿液中3種待測物的檢出限均為0.1 ng／mL，定量限均為0.3 ng／mL。目前馬鈴薯中毒時血和尿中生物堿的濃度未知，Hellenas等［15］報道7名志愿者以0.4 mgα－龍葵堿／kg體重和0.6 mgα－卡茄堿／kg體重的劑量食用馬鈴薯。在食用5～6 h后，α－龍葵堿和α－卡茄堿在血液中的濃度達到峰值，血清中平均峰質量濃度分別為7.7 ng／mL 和14.4 ng／mL；而在食后8～25 h內茄啶達到峰值（1.0～4.8 ng／mL）。以上質量濃度均在本法的線性范圍內，因此本法能夠滿足檢測的要求。

2.4 精密度和加標回收試驗

空白樣品添加0.3、10和70 ng／mL 的3種待測物進行加標回收和精密度試驗，結果見表2。血漿和尿液中的加標回收率分別為82%～112%和96%～114%，相對標準偏差分別為4.0%～16%和2.7%～17%（n＝6），符合痕量分析的要求。

2.5 樣品的穩(wěn)定性

分別用空白血漿和尿液加標，配制成含10 ng／mL的3種待測物的質控樣品進行3次冷凍和解凍循環(huán)（－20℃至室溫），測定并與新制備的樣品進行比較，結果的相對偏差的絕對值均小于10%。含10 ng／mL的3種待測物的血漿和尿液質控樣品的處理液置于自動進樣瓶中，在樣品室中室溫放置24 h后與新處理的樣品進行比較，結果的相對偏差的絕對值均小于8%。結果表明在上述條件下樣品不會有明顯的分解。

表2 血漿和尿液中3種馬鈴薯生物堿的加標回收率和相對標準偏差（n＝6）Table 2 Recoveries and RSDs of the three glycoalkaloids spiked in plasma and urine（n＝6）

3 結論

本文建立了一種超高效液相色譜－串聯(lián)質譜方法快速測定血漿和尿液中的α－龍葵堿、α－卡茄堿和茄啶。通過樣品的提取回收率和MCX SPE凈化后目標物基質效應的評估，驗證了樣品前處理方法的有效性。通過優(yōu)化液相色譜條件與質譜采集參數(shù)，得到了較佳的儀器檢測條件。方法學考察表明，該方法具有簡便、快速、靈敏等優(yōu)點，可作為馬鈴薯中毒的快速檢測方案推廣應用。

［1］ Langkilde S，Mandimika T，Schr?der M，et al.Food Chem Toxicol，2009，47（6）：1099

［2］ Gong J，Ni S F，Qiu L H，et al.Journal of Anhui Agricultural Sciences（鞏江，倪士峰，邱莉惠，等.安徽農(nóng)業(yè)科學），2009，37（9）：4108

［3］ Li M，Xiong X Y，Hu X X，et al.Hunan Agricultural Sciences（李美，熊興耀，胡新喜，等.湖南農(nóng)業(yè)科學），2012（23）：84

［4］ Friedman M.J Agric Food Chem，2006，54（23）：8655

［5］ Yang Y，Wang X G，Wang C.Chinese Journal of Public Health（楊煜，王學工，王闖.中國公共衛(wèi)生），1995，11（3）：133

［6］ Xiao W J，Li Q，Xiong X Y，et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry（肖文軍，李勤，熊興耀，等.分析化學），2011，39（9）：1459

［7］ Laurila J，Laakso I，V??n?nen T，et al.J Agric Food Chem，1999，47（7）：2738

［8］ Abell D C，Sporns P.J AOAC Int，1999，82（4）：908

［9］ Friedman M，Bautista F F，Stanker L H，et al.J Agric Food Chem，1998，46（12）：5097

［10］ Cataldi T R I，Lelario F，Bufo S A.Rapid Commun Mass Spectrom，2005，19（21）：3103

［11］ Shakya R，Navarre D A.J Agric Food Chem，2008，56（16）：6949

［12］ Matsuda F，Morino K，Miyazawa H，et al.Phytochem Anal，2004，15（2）：121

［13］ Sheridan R S，Kemnah J L.J Chromatogr Sci，2010，48（10）：790

［14］ Wu H M，Zeng J，Li M，et al.Food Science（伍慧敏，曾靜，李美，等.食品科學），2013，34（24）：121

［15］ Hellenas K E，Nyman A，Slanina P，et al.J Chromatogr Biomed Appl，1992，573（1）：69

［16］ Chen C，Yan H，Shen B H，et al.Chinese Journal of Chromatography（陳聰，嚴慧，沈保華，等.色譜），2012，30（5）：445

［17］ Tang Y，Zhang S Q，Li X，et al.Chinese Journal of Chromatography（湯瑤，張雙慶，李響，等.色譜），2012，30（2）：154

［18］ Zhang X Y，Cai X X，Zhang X Y.Chinese Journal of Chromatography（張秀堯，蔡欣欣，張曉藝.色譜），2010，28（1）：23

［19］ Commission Decision 2002／657／EC of 12 August 2002.Implementing Council Directive 96／23／EC Concerning the Performance of Analytical Methods and the Interpretation of Results（2002）.Off J Eur Comm，L221：8