張鴻偉， 許 輝， 高建國(guó)， 梁成珠， 徐 彪，耿 娟， 王鳳美， 張曉梅， 程 剛

（1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東 青島266002；2.青島出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 青島266001）

β－受體阻斷劑（β－blockers，BBs）是一類能選擇性地與β－腎上腺素受體結(jié)合，從而拮抗神經(jīng)遞質(zhì)和兒茶酚胺對(duì)β－受體激動(dòng)作用的藥物，是臨床上防治心律失常、心絞痛、高血壓、心動(dòng)過(guò)速、甲狀腺毒癥、肥厚性主動(dòng)脈狹窄以及心臟梗死的首選治療劑［1，2］。由于該類藥物具有一定的鎮(zhèn)靜作用，能提高某些運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目的成績(jī)，常被非法使用于體育賽事而被世界反興奮劑組織（WADA）所禁用［3］。BBs在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中也常被非法用作鎮(zhèn)靜劑，一方面通過(guò)降低動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)量來(lái)促進(jìn)飼料轉(zhuǎn)化率；另一方面還可緩解應(yīng)激反應(yīng)以降低動(dòng)物在運(yùn)輸、交配、分娩等壓力下的發(fā)病率和死亡率以及避免對(duì)肉質(zhì)的不良影響［4，5］。BBs常通過(guò)肌肉注射和靜脈注射方式給藥，且往往在動(dòng)物屠宰或運(yùn)輸前數(shù)小時(shí)使用，導(dǎo)致其在可食動(dòng)物組織中殘留風(fēng)險(xiǎn)較高，對(duì)人體造成的健康風(fēng)險(xiǎn)更大。目前，國(guó)際上一些地區(qū)和組織已對(duì)BBs類藥物卡拉洛爾（carazolol）在動(dòng)物組織中的殘留限量做出了明確要求［6，7］（歐盟和國(guó)際食品法典委員會(huì)規(guī)定豬肌肉中殘留限量為5μg／kg，豬肝、腎為25 μg／kg）。我國(guó)當(dāng)前既未批準(zhǔn)BBs可作為獸藥使用，也未明確相關(guān)限量要求。經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)使得BBs在畜牧養(yǎng)殖加工業(yè)中存在違法使用的風(fēng)險(xiǎn)，因此建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)方法尤為必要。

關(guān)于食源性動(dòng)物組織中BBs殘留分析的報(bào)道相對(duì)較少，現(xiàn)有文獻(xiàn)多采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS／MS）進(jìn)行檢測(cè)。由于動(dòng)物源基質(zhì)的復(fù)雜性，BBs殘留分析前處理過(guò)程多涉及液－液萃取（LLE）、固相萃?。⊿PE）凈化等過(guò)程，處理通量較低［8，9］。而快速分析［10］則因通量因素導(dǎo)致凈化程度不夠，方法定量限水平較高（～20μg／kg）。隨著Anastassiades等［11］基于QuEChERS方法使用N－丙基乙二胺（PSA）進(jìn)行分散固相萃?。╠ispersive solid－phase extraction，d－SPE）凈化，d－SPE技術(shù)以其簡(jiǎn)單快速、效果明顯的特點(diǎn)在生物樣品藥物殘留分析中應(yīng)用逐漸廣泛［12－14］。近年來(lái)超高效／快速液相色譜（UPLC／UFLC）和亞2μm色譜柱技術(shù)的發(fā)展成熟給分析領(lǐng)域帶來(lái)了新的變化，高通量超快速分析已成為殘留分析的發(fā)展趨勢(shì)［15］；另外，雜交型串聯(lián)質(zhì)譜儀，如四極桿／線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀（Q／Trap MS）因兼具四極桿與離子阱雙重功能，可快速完成檢測(cè)和確證的相關(guān)報(bào)道也逐年增多［16－18］。本文綜合應(yīng)用d－SPE凈化、超快速色譜分離、雜交質(zhì)譜儀高級(jí)質(zhì)譜采集模式等手段建立了豬組織中9種BBs（阿替洛爾、吲哚洛爾、醋丁洛爾、美托洛爾、卡拉洛爾、拉貝洛爾、比索洛爾、普萘洛爾和噴布洛爾）殘留的快速檢測(cè)技術(shù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

1290 Infinity超快速液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；5500 Q／Trap四極桿／線性離子阱質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex公司），配有電噴霧離子源（ESI），應(yīng)用軟件為Analyst（1.5.2版本）；CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī)（日本 Hitachi公司）；Caliper TurboVap?LV高通量水浴氮吹濃縮儀（美國(guó)Caliper公司）；SHAB水浴恒溫振蕩器（中國(guó)國(guó)華公司）。

甲醇、乙腈（LC－MS級(jí)，美國(guó) Merck公司），β－葡糖苷酸／硫酸酯酶、乙酸、甲酸及甲酸銨（分析純，美國(guó)Sigma－Aldrich公司）；乙酸銨、氯化鈉、Na2EDTA、氫氧化鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；水為Milli－Q Advantage A10系統(tǒng)制備的超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。

乙酸銨緩沖液：15.4 g乙酸銨用水溶解并定容至1 L，用乙酸調(diào)pH值為5.2。提取溶液：將37.5 g Na2EDTA溶于乙酸銨緩沖液中并定容至1 L。

BBs標(biāo)準(zhǔn)品：阿替洛爾（atenolol，純度99.0%）、美托洛爾（metoprolol tartrate，純度99.5%）、卡拉洛爾（carazolol，純度99.0%）和比索洛爾（bisoprolol fumarate，純度99.0%）（德國(guó) Dr.Ehrenstorfer公司）；吲哚洛爾（pindolol，純度98.0%）和拉貝洛爾（labetalol hydrochloride，純度98.0%）（加拿大 Toronto Research Chemicals公司）；醋丁洛爾（acebutolol hydrochloride，純度100%）和普萘洛爾（propranolol hydrochloride，純 度 100%）（美 國(guó) Sigma－Aldrich公司）；噴布洛爾（penbutolol sulfate，純度99.0%）（歐洲藥品質(zhì)量和衛(wèi)生保健理事會(huì)（EDQM））；BBs氘代同位素內(nèi)標(biāo)：atenolol－d7（純度98.0%）、pindolol－d7（純 度 97.0%）、acebutolol－d5（純度98.0%）、metoprolol－d7（純度98.0%）、bisoprolol－d5（純 度 98.0%）和 penbutolol－d9 hydrochloride（純 度99.6%）（加拿大 Toronto Research Chemicals公司）；carazolol－d7（純度99.5%）（德國(guó) Dr.Ehrenstorfer公司）；propranolol－d7（純 度 99.0%）（加 拿 大 C／D／N Isotopes公司）。

BBs標(biāo)準(zhǔn)溶液：除比索洛爾外，分別取其他BBs標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容配制成1.0 g／L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于－20℃保存；比索洛爾標(biāo)準(zhǔn)品為0.01 g／L 的乙腈＋0.5%H3PO4水溶液（1∶1，v／v），可直接作為儲(chǔ)備液使用，于（20±4）℃保存。稱取各氘代內(nèi)標(biāo)5.0 mg于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容配制成0.1 g／L 的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，于－20℃保存；實(shí)驗(yàn)中用0.2%（v／v）甲酸水溶液稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

d－SPE凈化管（BondElut，15 mL，High Pigment）購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；硅藻土為國(guó)產(chǎn)分析純材料；實(shí)驗(yàn)中所用豬肉、豬肝和豬腎樣品均為市售。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex?KinetexTMC18－XB（150 mm×2.1 mm，2.6μm）；柱溫：30 ℃；流速：0.25 mL／min；進(jìn)樣量：3μL；流動(dòng)相：A為甲醇，B為水（含0.1%（v／v）甲酸）；梯度洗脫程序：0～5 min，5%A～70%A；5～6 min，70%A～100%A；6～7 min，100%A；7～7.1 min，100%A～5%A；7.1～10 min，5%A。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子化方式：ESI＋；采集模式：預(yù)設(shè)定多反應(yīng)監(jiān)測(cè)－信息依賴性采集－增強(qiáng)子離子掃描（sMRM－IDAEPI）；sMRM參數(shù)：檢測(cè)窗口45 s，目標(biāo)掃描時(shí)間1 s；IDA參數(shù)：采集閾值 3 000 cps（勾選動(dòng)態(tài)背景扣除）；EPI參數(shù)：掃描速率 10 000 Da／s，掃描質(zhì)量數(shù)范圍m／z 50～400，碰撞能量35 eV，擴(kuò)展碰撞能量15 eV，離子阱時(shí)間選動(dòng)態(tài)填充；離子源參數(shù)：離子源溫度500℃，霧化氣（氮?dú)猓毫?.276 MPa，氣簾氣（氮?dú)猓毫?.241 MPa，輔助氣（壓縮空氣）壓力0.344 MPa，電噴霧電壓5 500 V；化合物參數(shù)：BBs各化合物及其內(nèi)標(biāo)母離子、子離子的碰撞能量、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子對(duì)見表1。

表1 BBs類藥物及其內(nèi)標(biāo)sMRM模式下的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters for BBs and their internal standards in sMRM mode

1.3 樣品前處理

稱取2.0 g均質(zhì)后組織試樣，置于50 mL離心管中，加入混合內(nèi)標(biāo)溶液40μL（相當(dāng)于試樣中含量2μg／kg），于暗處?kù)o置15 min后加入β－葡糖苷酸／硫酸酯酶液40μL和提取溶液5 mL，渦旋1 min，50℃水浴中振蕩水解1 h，取出冷卻至室溫，用2 mol／L NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH至10.0。

在提取液中加入25 mL乙腈、2 g硅藻土和2 g NaCl，渦旋后振蕩10 min，在0 ℃、10 000 r／min下離心10 min；取10 mL上清液加入d－SPE凈化管中，渦旋后振蕩5 min，在0℃、10 000 r／min 下離心5 min；取5 mL上清液于40℃下氮吹至近干，用0.5 mL甲醇超聲溶解后轉(zhuǎn)移至2 mL Eppendorf管中，在0℃、15 000 r／min下離心10 min，取上清液于40℃下氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1 mL甲醇－水（含0.2%（v／v）甲酸）（1∶9，v／v）復(fù)溶殘?jiān)?，過(guò)0.22μm濾膜后測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇與優(yōu)化

BBs類藥物通常含有R－O－CH2－CH（OH）－CH2－NH－CH（CH3）2結(jié)構(gòu)，在ESI＋條件下易形成質(zhì)譜特征碎片離子 m／z 116［（N－異丙基－N－2－羥丙基胺）＋H］＋（見表1）；此外，常見的中性丟失有氨基、水、烯烴基等，碎片離子信息豐富［19］。在質(zhì)譜方法建立時(shí)，盡可能采集更多的碎片離子用于方法的篩選，對(duì)于改善方法的性能指標(biāo)如測(cè)定低限、準(zhǔn)確度和精密度等有積極意義。以噴布洛爾為例，圖1顯示了其6個(gè)不同碎片離子組成的sMRM掃描標(biāo)準(zhǔn)溶液、腎臟基質(zhì)空白和加標(biāo)腎臟基質(zhì)空白的質(zhì)量色譜圖。由圖1可見，6個(gè)sMRM譜圖中m／z 292.2／74.0顯示出較強(qiáng)的基質(zhì)干擾，導(dǎo)致選擇性差；m／z 292.2與113.1、168.1、56.0組成離子對(duì)的sMRM譜圖信噪比較差；故優(yōu)選出選擇性強(qiáng)、信噪比優(yōu)的 m／z 292.2／236.2與 m／z 292.2／201.2進(jìn)行定量和定性。本文針對(duì)9種BBs及8種同位素內(nèi)標(biāo)共預(yù)選了91對(duì)sMRM離子進(jìn)行篩選，優(yōu)選后的sMRM離子見表1。

歐盟2002／EC／657委員會(huì)決議［20］規(guī)定了質(zhì)譜確證分析的相關(guān)要求，包括確證點(diǎn)的要求、離子比率和保留時(shí)間的容許范圍等。但在實(shí)際分析中，有時(shí)采用上述確證規(guī)則時(shí)會(huì)出現(xiàn)困擾。如Kaufmann等［21］發(fā)現(xiàn)對(duì)于單電荷離子存在多質(zhì)子位點(diǎn)的化合物（如雙氟沙星等）采用歐盟確證規(guī)則會(huì)導(dǎo)致結(jié)果誤判。Dahane等［18］也認(rèn)為在離子對(duì)響應(yīng)差別較大（10倍以上）時(shí)采用歐盟規(guī)則進(jìn)行低濃度水平確證分析存在困難。本文中噴布洛爾優(yōu)選的兩個(gè)離子對(duì)響應(yīng)差別在6倍以上（見圖1），在低濃度水平時(shí)由于定性離子絕對(duì)響應(yīng)較低，定量時(shí)容易導(dǎo)致離子比率接近容許限而出現(xiàn)結(jié)果判定困難。Q／Trap型質(zhì)譜儀可在線實(shí)時(shí)獲取目標(biāo)物的全掃描碎片圖譜，可作為確證分析的有效輔助判據(jù)［16－18］而改善判定困境。本文BBs在線質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建采用sMRMIDA－EPI模式，質(zhì)譜參數(shù)設(shè)定見1.2.2節(jié)，BBs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（2μg／L）在優(yōu)化的色譜條件（見1.2.1節(jié)）下分析，采集各目標(biāo)物的EPI譜圖，同時(shí)采用空白組織（肝臟、腎臟和肌肉）基質(zhì)制備BBs基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（2μg／L），在相同條件下分析，采集相應(yīng)的EPI譜圖，并與標(biāo)準(zhǔn)溶液采集的EPI譜圖進(jìn)行在線比對(duì)。匹配分析使用 Analyst 1.5.2（AB SCIEX）軟件進(jìn)行，結(jié)果顯示各目標(biāo)物的EPI譜圖匹配純度（purity）值均大于95（完全匹配值為100），提示可使用標(biāo)準(zhǔn)溶液建立的EPI譜庫(kù)對(duì)測(cè)定樣品進(jìn)行匹配分析。9種BBs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（2μg／L）按本文的色譜－質(zhì)譜條件在線采集的EPI譜圖和選擇離子流圖見圖2。

2.2 色譜條件的選擇與優(yōu)化

9種BBs類藥物均為堿性化合物（p Ka≈9.5），其log P值范圍為0.34～4.02（使用歐洲生物信息研究所在線數(shù)據(jù)庫(kù)ACD軟件預(yù)測(cè)），顯示其極性范圍較寬。為了實(shí)現(xiàn)寬極性范圍堿性目標(biāo)物的超快速色譜分析，除采用超快速色譜硬件系統(tǒng)外，色譜柱與流動(dòng)相的選擇也是關(guān)鍵。

近年來(lái)，一些采用了新的填料類型或新型固定相結(jié)構(gòu)的色譜柱在超快速分析中有更好的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)［22］，其中核－殼型色譜柱在堿性物質(zhì)和寬極性范圍多殘留分析中有較好表現(xiàn)［16，23］。本文先后考察了5種不同類型、品牌和規(guī)格的C18色譜柱，分別為柱1（Shiseido Capcell MG III C18，150 mm×3.0 mm，5μm）、柱 2（Chromex Scientific Sunshell C18，150 mm×2.1 mm，2.6μm）、柱3（Merck Chromolith Performance C18e，100 mm ×2.1 mm）、柱4（Phenomenex Gemini－NX C18，150 mm×4.6 mm，3μm）和柱5（Phenomenex Kinetex C18－XB，150 mm×2.1 mm，2.6μm）。其中柱1適用于在酸性條件下分離堿性物質(zhì)；柱2和柱5均為核－殼型色譜柱，傳質(zhì)效率高，適合快速分析；柱3為整體柱，背壓極低，適合超高流速分析；柱4為B型硅膠固定相，可在高pH下進(jìn)行堿性化合物分析。在流動(dòng)相選擇上，堿性化合物分析通常多采用酸性流動(dòng)相以減免硅醇?xì)埢鶎?duì)離子化目標(biāo)物的吸附作用而出現(xiàn)峰形不對(duì)稱、分辨率低或保留不重現(xiàn)等現(xiàn)象；或是采用堿性流動(dòng)相選用耐堿色譜柱進(jìn)行分析。因此，本文以水－甲醇／乙腈分別組合作為流動(dòng)相，再選用氨水、甲酸、乙酸及其銨鹽為流動(dòng)相修飾劑并調(diào)節(jié)洗脫梯度，選用適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相體系，觀察不同條件下BBs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)物的分離度、色譜峰形、靈敏度及分析通量。結(jié)果顯示：這5種色譜柱均能在可接受的分離度下完成對(duì)9種BBs的超快速分析（單次分析循環(huán)不超過(guò)10 min），在4種適用酸性流動(dòng)相體系的色譜柱中，柱5（Phenomenex Kinetex C18－XB）在靈敏度、色譜峰形和分離度上表現(xiàn)最優(yōu)，而柱1靈敏度較低，柱2和柱3靈敏度低且有峰拖尾現(xiàn)象；柱4使用堿性流動(dòng)相體系（pH10.0）進(jìn)行分析，在靈敏度、色譜峰形和分離度方面均與柱5相當(dāng)，然而其優(yōu)化的流速為0.8 mL／min，而柱5的優(yōu)化流速為0.25 mL／min，在流動(dòng)相和用氣量消耗方面柱5更為優(yōu)秀，故最終選擇核－殼型色譜柱（Phenomenex Kinetex C18－XB）為本文分析用柱。在流動(dòng)相的選擇上，甲醇－水體系在10 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)7種BBs的基線分離且在0.1%（v／v）甲酸的酸度下就能實(shí)現(xiàn)靈敏度和色譜峰形的優(yōu)化，而乙腈－水體系僅能實(shí)現(xiàn)6種BBs的基線分離且需在0.3%（v／v）甲酸下才能有較好的分離效果，故最終選擇流動(dòng)相為甲醇與水（含0.1%（v／v）甲酸）并在1.2.1節(jié)的梯度條件下洗脫。9種BBs在優(yōu)化的色譜條件下的色譜圖見圖2中的XIC of sMRM圖。

圖1 （a）噴布洛爾標(biāo)準(zhǔn)溶液（2μg／L）、（b）腎臟空白基質(zhì)和（c）添加噴布洛爾（2μg／L）的腎臟空白基質(zhì)的sMRM 圖譜Fig.1 sMRM spectra of（a）standard solution of penbutolol（2μg／L），（b）blank kidney matrix and（c）the blank kidney matrix spiked with penbutolol at 2μg／L

圖2 9種BBs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（2μg／L）在線EPI譜圖及選擇離子流圖Fig.2 On－line EPI spectra and XIC chromatogram of the nine BBs acquired with composite standard solution（2μg／L）

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

BBs類部分藥物（通常為含有酚基結(jié)構(gòu)的藥物如拉貝洛爾和卡拉洛爾）易在生物體內(nèi)形成葡糖醛酸軛合物或硫酸軛合物［5，24］。本文選用快速酶解方法［25，26］保證了處理通量并解離了可能的結(jié)合態(tài)殘留藥物，接近中性（pH5.2）的酶解環(huán)境能顯著減少基質(zhì)共萃取物［27］，緩沖液中加入EDTA可減免強(qiáng)極性目標(biāo)物與金屬陽(yáng)離子形成復(fù)合物而影響提取效率［2，28］。提取溶劑選擇乙腈是因其較甲醇有更好的蛋白沉淀作用、共萃取作用弱且可以鹽析分層，實(shí)驗(yàn)顯示其提取液較為清澈，基質(zhì)效應(yīng)弱。BBs在水溶液中呈堿性，酶解完成后堿化水相和鹽析有利于目標(biāo)物去電荷而向有機(jī)相分配，提升提取效率［2，29］。實(shí)驗(yàn)分別調(diào)節(jié)pH值為9.5、10.0和11.0，結(jié)果顯示pH值為10.0時(shí)各目標(biāo)物的提取效率最優(yōu)，這與文獻(xiàn)［30］的報(bào)道一致，故選擇調(diào)節(jié)pH為10.0。

基于QuEChERS方法的d－SPE技術(shù)可有效提高前處理通量。本文分別考察了硅藻土、C18填料以及QuEChERS方法組合凈化劑（MgSO4＋PSA＋C18）的d－SPE效果。結(jié)果顯示：在3種基質(zhì)中，硅藻土和組合凈化劑的使用效果相當(dāng)且均優(yōu)于C18填料，并以在肌肉基質(zhì)中的使用效果最優(yōu)。基于實(shí)驗(yàn)成本考慮，選用硅藻土為凈化吸附劑。然而對(duì)于肝、腎基質(zhì)，僅采用一次d－SPE處理提取液，發(fā)現(xiàn)有明顯的色素存在，對(duì)低濃度水平（如0.5μg／kg）的分析有較強(qiáng)的影響。為了減弱基質(zhì)干擾，本文采用BondElut組合凈化填料（150 mg PSA＋45 mg石墨化炭黑（GCB）＋855 mg MgSO4）進(jìn)行二次d－SPE凈化（GCB和PSA均可吸附親脂性色素），并采用甲醇復(fù)溶進(jìn)一步去除磷脂類干擾物以防止溶劑轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的分析物損失［9，17］，再輔以高速冷凍離心，結(jié)果顯示：肝、腎基質(zhì)的提取液明顯清澈，基質(zhì)干擾現(xiàn)象減弱；肌肉基質(zhì)經(jīng)過(guò)二次凈化后，基質(zhì)影響更為減弱。圖3顯示了3種豬組織空白基質(zhì)與加標(biāo)（0.5 μg／kg）空白基質(zhì)的總離子流圖。

由圖3可見，在添加水平為0.5μg／kg時(shí)，3種豬組織中各目標(biāo)物在保留時(shí)間窗口內(nèi)無(wú)明顯干擾。另外，方法中各BBs的絕對(duì)回收率范圍為52.4%～76.2%，顯示本文離子對(duì)優(yōu)化選擇的有效性及前處理方法設(shè)計(jì)的合理性。此外，本文8種BBs同位素內(nèi)標(biāo)的sMRM離子（見表1）在其保留時(shí)間窗口內(nèi)亦無(wú)明顯干擾（數(shù)據(jù)略）。同時(shí)，依據(jù)前處理絕對(duì)回收率計(jì)算結(jié)果，拉貝洛爾以吲哚洛爾氘代內(nèi)標(biāo)為內(nèi)標(biāo)（兩者絕對(duì)回收率最為接近）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及定量計(jì)算。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系和定量限

圖3 （a）加標(biāo)（0.5μg／kg）豬空白組織和（b）豬空白組織的sMRM總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of（a）blank porcine tissues spiked with BBs at 0.5μg／kg and （b）blank porcine tissues

使用甲醇－水（含0.2%（v／v）甲酸）（1∶9，v／v）溶液配制質(zhì)量濃度分別為0.10、0.20、0.50、1.0、5.0、10、20μg／L（同位素內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為 0.8 μg／L）的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的色譜－質(zhì)譜條件下測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量，線性回歸采用1／x權(quán)重（校正低濃度端準(zhǔn)確度），在滿足準(zhǔn)確度在80%～120%的基礎(chǔ)上計(jì)算相關(guān)系數(shù)（r），9種BBs的線性關(guān)系見表2。由表2可見，BBs由于其質(zhì)譜響應(yīng)較高，其線性范圍有所收窄，換算成樣品中含量范圍為0.25～50μg／kg，表明方法在低濃度水平有更好的定量精度，有利于BBs濫用的控制。

本文以在空白組織基質(zhì)中添加BBs，將定量離子對(duì)的信噪比≥10定義定量限，參照目前國(guó)際上對(duì)卡拉洛爾的限量要求及以提高風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)水平為目的，基質(zhì)空白添加水平選取為0.5μg／kg，計(jì)算各目標(biāo)物在此水平上的信噪比。結(jié)果顯示9種BBs在0.5μg／kg 添加水平時(shí)，3種豬組織基質(zhì)中各目標(biāo)物定量離子對(duì)的S／N≥15，說(shuō)明采用本方法各目標(biāo)物定量限均可達(dá)到0.5μg／kg。

表2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中9種BBs的線性關(guān)系Table 2 Linear relationships of the nine BBs in a mixed standard solution

2.4.2 方法的回收率和精密度

本文分別選用空白豬肝、豬腎和豬肉基質(zhì)，參照《進(jìn)出口食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制指南［2011］398號(hào)》的規(guī)定，添加0.5、1.0和5.0μg／kg進(jìn)行回收率測(cè)定，每個(gè)水平6個(gè)試樣，計(jì)算回收率與RSD，結(jié)果見表3。在3個(gè)添加水平下BBs的平均回收率為87.5%～111.8%，RSD≤12.5%，顯示本方法對(duì)豬組織BBs殘留測(cè)定有很好的適用性和可重復(fù)性。

2.4.3 方法的基質(zhì)效應(yīng)

為了控制基質(zhì)效應(yīng)，本文采取的措施有：①采用選擇性更好的sMRM。②采用了多重凈化措施。③采用同位素內(nèi)標(biāo)補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)影響。選用了8種BBs同位素內(nèi)標(biāo)并優(yōu)化了監(jiān)測(cè)離子對(duì)（見表1），對(duì)沒有同位素內(nèi)標(biāo)的拉貝洛爾通過(guò)絕對(duì)回收率考察選擇了合適的替代內(nèi)標(biāo)，其定量結(jié)果顯示在3個(gè)添加水平上回收率為89.4%～106.1%，RSD≤12.5%，顯示了替代內(nèi)標(biāo)選擇的合理性。④稀釋提取液。通過(guò)縮減提取液體積降低引入基質(zhì)組分的絕對(duì)量。⑤降低進(jìn)樣量。將進(jìn)樣量降低至3μL，減少基質(zhì)負(fù)載。通過(guò)上述措施，本文建立的方法有效地控制了豬組織中BBs殘留分析的基質(zhì)效應(yīng)影響（見圖3），定量結(jié)果滿足殘留分析要求（見表3）。

表3 豬組織中9種BBs的加標(biāo)回收率及精密度（n＝6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations for the nine BBs spiked in blank porcine tissues（n＝6）

2.4.4 方法EPI譜圖譜庫(kù)比對(duì)純度閾值的確定

本文使用在線EPI譜圖譜庫(kù)比對(duì)進(jìn)行BBs快速輔助確證。研究對(duì)定量限（0.5μg／kg）水平各組織基質(zhì)中BBs的絕對(duì)響應(yīng)進(jìn)行評(píng)估，確定IDA掃描觸發(fā)閾值水平為3 000 cps，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的EPI在線譜庫(kù)為參照庫(kù)（見圖2），參照文獻(xiàn)［16］的方法確定譜庫(kù)比對(duì)純度閾值為80。測(cè)試中樣品BBs的在線EPI譜圖匹配純度值超過(guò)80即可作為輔助確證分析的有效判據(jù)。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

使用本文建立的方法對(duì)從青島一農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)不同攤位采集的20份豬相關(guān)組織樣品進(jìn)行BBs殘留測(cè)定分析，該批次測(cè)定樣品中未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)BBs殘留。盡管此次采樣沒有監(jiān)測(cè)到相關(guān)物質(zhì)殘留，但是對(duì)覆蓋不同地域不同來(lái)源的更廣泛的樣品進(jìn)行BBs殘留監(jiān)測(cè)，對(duì)于食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控體系的完善有重要的實(shí)踐意義。

3 結(jié)論

本文使用超快速液相色譜－四極桿／離子阱質(zhì)譜建立了豬組織中9種BBs殘留測(cè)定的分析方法。該研究進(jìn)行了監(jiān)測(cè)離子對(duì)的篩選優(yōu)化，并采用雙重d－SPE等凈化手段有效控制了復(fù)雜動(dòng)物源樣品的基質(zhì)效應(yīng)，降低了方法的定量限，質(zhì)譜分析采用sMRM－IDA－EPI高級(jí)采集模式，在線EPI譜庫(kù)輔助確證分析，提高了檢測(cè)效能和確證可靠性。該方法快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性好、適用性強(qiáng)，定量限滿足國(guó)內(nèi)外相關(guān)法規(guī)要求，可有效用于BBs殘留監(jiān)控監(jiān)測(cè)和實(shí)驗(yàn)室日常分析。

［1］ Sleiman O I，Murin J，Ghanem W M.Bratisl Med J，2001，102（7）：332

［2］ Hernando M D，Gomez M J，Aguera A，et al.Trends Anal Chem，2007，26（6）：581

［3］ World Anti－Doping Agency.The World Anti－Doping Code：The 2013 Prohibited List，International Standard.［2013－12－26］.http：／www.wada－ama.org／en／Science－Medicine／Prohibited－List／

［4］ Balizs G，Hewitt A.Anal Chim Acta，2003，492（1）：105

［5］ Pang G F，et al.Modern Techniques for Residue Analysis of Pesticides and Veterinary Drugs.Beijing：Science Press（龐國(guó)芳，等.農(nóng)藥獸藥殘留現(xiàn)代分析技術(shù).北京：科學(xué)出版社），2007

［6］ CODEX Alimentarius.Veterinary Drug Residues in Food.［2013－12－26］.http：／www.codexalimentarius.net／vetdrugs／data／vetdrugs／index.html

［7］ Commission Regulation（EU）37／2010

［8］ Zhang J，Shao B，Yin J，et al.J Chromatogr B，2009，877：1915

［9］ Fan S，Miao H，Zhao Y F，et al.J Agric Food Chem，2012，60（8）：1898

［10］ Mitrowska K，Posyniak A，Zmudzki J.Anal Chim Acta，2009，637（1／2）：185

［11］ Anastassiades M，Lehotay S J，Stajnbaher D，et al.J AOAC Int，2003，86（2）：412

［12］ Stubbings G，Bigwood T.Anal Chim Acta，2009，637（1／2）：68

［13］ Aguilera－Luiz M M，Martinez Vidal J L，Romero－Gonzalez R，et al.Food Chem，2012，132（4）：2171

［14］ Lombardo－Agui M，Garcia－Campanna A M，Gamiz－Gracia L，et al.Talanta，2012，93：193

［15］ O’Mahony J，Clarke L，Whelan M，et al.J Chromatogr A，2013，1292：83

［16］ Zhang H W，Jian H M，Lin L M，et al.Journal of Instrumental Analysis（張鴻偉，簡(jiǎn)慧敏，林黎明，等.分析測(cè)試學(xué)報(bào)），2012，31（7）：763

［17］ Zhang H W，Cai X，Lin L M，et al.Chinese Journal of Chromatography（張鴻偉，蔡雪，林黎明，等.色譜），2012，30（10）：991

［18］ Dahane S，Gil Garcia M D，Martinez Bueno M J，et al.J Chromatogr A，2013，1297：17

［19］ Salem A A，Wasfi I A，Al－Nassibi S S，et al.J Chromatogr B，2012，908：27

［20］ Commission Decision 2002／657／EC

［21］ Kaufmann A，Butcher P，Maden K，et al.Rapid Commun Mass Spectrom，2009，23（7）：985

［22］ Chester T L.Anal Chem，2013，85（2）：579

［23］ Kaufmann A，Butcher P，Maden K，et al.Anal Chim Acta，2011，700（1／2）：86

［24］ Wang J，Xiao T A，F(xiàn)ang B H，et al.Progress in Veterinary Medicine（王軍，肖田安，方炳虎，等.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展），2011，32（3）：113

［25］ Peters R J B，Oosterink J E，Stolker A A M，et al.Anal Bioanal Chem，2010，396（7）：2583

［26］ Kumar P，Rubies A，Centrich F，et al.Anal Chim Acta，2013，780：65

［27］ Gomez M J，Petrovic M，F(xiàn)ernandez－Alba A R，et al.J Chromatogr A，2006，1114：224

［28］ Choi J H，Lamshoft M，Sebastian Z，et al.J Chromatogr A，2012，1260：111

［29］ Kadam R S，Kompella U B.J Chromatogr B，2009，877：253

［30］ Vieno N M，Tuhkanen T，Kronberg L.J Chromatogr A，2006，1134：101