陸文淵， 張 揚， 沈誠頻， 殷薛飛， 劉曉慧， 楊芃原

(1.復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系，上海200433;2.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究院，上海200032)

色譜技術(shù)作為日漸成熟的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最為重要的分離手段之一，與樣品預(yù)處理以及生物信息學(xué)分析一樣，存在著蛋白質(zhì)組學(xué)研究中一些需要解決的難題。色譜條件的選擇直接影響蛋白質(zhì)的分離效率與質(zhì)量，并間接地對實驗結(jié)果產(chǎn)生著決定性的影響。但是，迄今為止的很長一段時間，無論是蛋白質(zhì)的定性還是定量，大多數(shù)實驗分析都以質(zhì)譜數(shù)據(jù)為主，而大量色譜實驗數(shù)據(jù)普遍被忽視。

色譜數(shù)據(jù)理應(yīng)被重視和運用于蛋白質(zhì)的分析中，但在實際分析中，色譜實驗數(shù)據(jù)又存在著難以處理的問題，如幾乎所有樣品的色譜數(shù)據(jù)中都會出現(xiàn)保留時間的偏移，這種偏移與液相流動速率、溫度以及柱壓等因素有關(guān)［1］;此外，樣品濃度的不同不僅會使色譜離子流圖的響應(yīng)值發(fā)生變化，還會使得特征峰發(fā)生保留時間上的偏移。因此，建立理想的校正方法，可以將不同濃度樣品的特征峰對齊，從而有助于在低濃度譜圖中鑒定出更多的肽段。

事實上，即使是同濃度的同種樣品在連續(xù)進(jìn)行的重復(fù)實驗中，色譜保留時間的偏移仍無法消除。對于復(fù)雜樣品來說，大量酶解肽段無一例外地出現(xiàn)了保留時間偏移，其結(jié)果勢必會對鑒定造成無法估計的影響。因此，對大部分流出峰進(jìn)行校正同樣也可以提高復(fù)雜體系中的肽段與蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量。

另外，除了色譜保留時間的偏移，質(zhì)譜m/z信號也存在無法避免的質(zhì)量偏移［2］，對蛋白質(zhì)鑒定造成影響。因此，對于蛋白質(zhì)定性定量分析實驗，保留時間和m/z信號雙方面的校正是一個非常有意義且富有挑戰(zhàn)的嘗試。本文以復(fù)雜樣品的定性分析為例，提出譜圖校正與后續(xù)處理流程，并且得到了較好的實際分析結(jié)果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

BreezeTMHPLC色譜儀，購自美國Waters公司;EASY-nLC 1000納升級液相色譜、Heraeus Megafuge 1.0R通用離心機，購自美國 ThermoFisher公司;TripleTOF5600質(zhì)譜儀，購自美國 ABSciex公司;Concentrator plus真空離心濃縮儀，購自美國Eppendorf公司;Symmetry C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，10 nm)，購自美國Waters公司;AQUASIL C18 反相色譜柱(50 cm ×75 μm，2 μm)，購自美國ThermoFisher公司;乙腈(ACN)、氨水(NH3·H2O)，色譜純，購自德國Merck公司;胞內(nèi)蛋白酶(lys-C)、胰蛋白酶(trypsin)，純度不低于95%;三氟乙酸(TFA)、二硫蘇糖醇(DTT)、吲哚乙酸(IAA)、碳酸氫銨均購自美國Sigma-Aldrich公司，使用前稀釋至指定濃度。

1.2 實驗樣品

樣品1:全細(xì)胞提取的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，用二甲基亞砜(DMSO)(溶解于8 mol/L尿素、100 mmol/L氯化鈉溶液中)刺激，共330 μg;樣品2:全細(xì)胞提取的HUVEC，用NEDD8激活酶抑制劑(MLN4924，MLN，溶解于8 mol/L尿素、100 mmol/L氯化鈉溶液中)刺激，共330 μg;樣品3:QconCAT蛋白質(zhì)混合物，蛋白質(zhì)絕對量跨度為4個數(shù)量級(見表1)，共26 μL。以上樣品皆由中國人類蛋白質(zhì)計劃(CNHPP)提供。

表1 QconCAT蛋白質(zhì)混合物絕對濃度表Table 1 Absolute amount of QconCAT protein mixture

1.3 樣品處理

對3份樣品分別進(jìn)行還原烷基化處理，具體方法:在56℃下，用10 mmol/L的DTT反應(yīng)0.5 h，隨后在37℃下，用20 mmol/L的IAA反應(yīng)0.5 h。

對刺激的兩份HUVEC樣品(即樣品1和樣品2)進(jìn)行以下酶解:先在37℃下，用胞內(nèi)蛋白酶(酶∶蛋白質(zhì) =1∶50，質(zhì)量比，下同)酶解 3 h，用 50 mmol/L的碳酸氫銨稀釋至兩倍體積，再在37℃下，依次用胰蛋白酶(酶∶蛋白質(zhì)=1∶50)和胰蛋白酶(酶∶蛋白質(zhì) =1∶100)酶解8 h和6 h;對 Qcon-CAT蛋白質(zhì)混合物(即樣品3)進(jìn)行以下酶解:在37℃下，用100 ng胞內(nèi)蛋白酶酶解3 h，再依次用胰蛋白酶100 ng和50 ng分別酶解8 h和6 h;再加入三氟乙酸至其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%來終止酶解，并用C18反相柱除鹽;將QconCAT酶解溶液平均分為兩份，分別加入DMSO與MLN刺激的細(xì)胞酶解液中，混合均勻后真空干燥，并復(fù)溶于高pH的色譜流動相A相溶液中，兩份分別標(biāo)記為樣品Ⅰ和樣品Ⅱ。

1.4 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

1.4.1 第一維高pH反相色譜流程

選用 Symmetry C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，10 nm)。流動相 A 相為乙腈-水(2∶98，v/v)(用氨水調(diào)pH等于10.0)，B相為乙腈-水(98∶2，v/v)(用氨水調(diào)pH等于10.0)。梯度洗脫程序如下:初始B相為5%，在5 min內(nèi)升至8%，在35 min內(nèi)從8%升至18%，在22 min內(nèi)從18%升至32%，在2 min內(nèi)從32%陡增至95%并保持4 min，最后在4 min內(nèi)從95%降至5%。將Ⅰ和Ⅱ兩份樣品分別按時間分布收集65個餾分(每1 min收集一個餾分)，凍干，之后再按順序每11份(最后一組為10份)合并成6個餾分準(zhǔn)備進(jìn)行第二維分離。

1.4.2 第二維反相色譜分離

選用 Aquasil C18色譜柱(50 cm ×75 μm，2 μm)。流動相A相為2%的乙腈與98%的水(含0.1%TFA)，B相為98%的乙腈與2%的水(含0.1%TFA)。梯度洗脫程序如下:初始B相為0，在30 min內(nèi)從0升至10%，在210 min內(nèi)從10%升至20%，在100 min內(nèi)從20%升至35%，在5 min內(nèi)從35%升至80%，在80%保持10 min，最后在5 min內(nèi)從80%降至0，并且保持40 min。

1.4.3 質(zhì)譜掃描

噴針外加電壓選用2.3 kV;掃描范圍為m/z 350～1 500的全掃描，掃描方式為高分辨模式(high resolution);串級質(zhì)譜掃描范圍為m/z 100～1 250、掃描模式為信息依賴性獲取模式(IDA，information dependent acquisition)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜校正方案選擇

2.1.1 特征峰檢測與譜圖校正的次序先后研究

譜圖校正的目標(biāo)是在信號噪聲中，將不同實驗中存在保留時間偏移、但具有相同特征的肽段流出峰對齊。自1998年以來，譜圖校正對齊的研究報道已有過不少，Nielsen等［3］首先建立了一套相關(guān)優(yōu)化規(guī)整算法(COW，correlated optimized warping algorithm)，隨后Wang等［4］在此基礎(chǔ)上研究了動態(tài)時間規(guī)整算法(DTW，dynamic time warping algorithm)，此外，還有如 May 等［5］編寫的 msInspect、Li等［6］與 Fugmann 等［7］編寫的 SpecArray 以及 Katajamaa等［8］編寫的MZmine等軟件可以進(jìn)行譜圖校正對齊。

概括起來，可以把這些校正方法歸為兩類。第一類方法是在特征峰檢測前對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行校正對齊，這類方法通過計算理想曲線方程將一次實驗的色譜保留時間對齊至另一次實驗。然而，曲線方程將整個色譜中的保留時間差異一齊納入了計算，因此，該方法并不能保證將單個肽段進(jìn)行校正對齊。第二類方法則是利用檢測完的特征峰列表進(jìn)行校正對齊，并且允許個別肽段存在一定范圍的保留時間差異。但是，這類方法依賴于對特征峰的預(yù)先檢測，而且無法利用原始譜圖數(shù)據(jù)的信息，因此特征峰檢測出現(xiàn)的錯誤會直接影響到整個譜圖的校正與對齊?？傊?，這兩類方法均只能用于相似度比較高的數(shù)據(jù)之間，而對于不同的樣品很有可能會出現(xiàn)錯誤，比如比較正常和癌變組織蛋白質(zhì)的實驗中。

由于第二類方法需要事先進(jìn)行特征峰的檢測，會在譜圖校正前引入額外的影響因素，因此，我們在第一類方法中選擇合適的算法并做進(jìn)一步研究。研究的內(nèi)容主要是從第一類方法中篩選出合適的算法，并挑選和利用現(xiàn)有的軟件進(jìn)行改進(jìn)，以符合預(yù)期的校正功能。

2.1.2 校正算法的研究

上文提到的第一類方法，主要有秩最小化規(guī)整［9］、抽象子空間差異規(guī)整［10］、動態(tài)時間規(guī)整［11］、參數(shù)時間規(guī)整［12］以及相關(guān)性優(yōu)化規(guī)整等。一直以來，這些方法只是在一般有機物的色譜鑒定中使用，無法直接運用于蛋白質(zhì)組學(xué)的實驗中。

當(dāng)比較兩次LC/MS實驗譜圖時，F(xiàn)ischer等［13］并沒有直接將兩次譜圖發(fā)生的保留時間偏移進(jìn)行校正對齊，而是選擇以其中一次實驗的保留時間作為函數(shù)的自變量，將兩次實驗譜圖的保留時間差值作為因變量，再進(jìn)行校正處理。由于計算量過于龐大，F(xiàn)ischer等開始并沒有將所有的數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，只是選取了一些可以得到鑒定的肽段流出峰。隨后，該方法被廣泛用于色譜-質(zhì)譜聯(lián)用數(shù)據(jù)的校正［14，15］，并且為后續(xù)的定性定量處理提供幫助。

2008年以來，Christin等［16］認(rèn)為基于總離子流(TIC)圖的保留時間校正方法只運用了保留時間一維信息，并沒有考慮到LC-MS數(shù)據(jù)中不同m/z信號對總離子流圖的貢獻(xiàn)，他們認(rèn)為用于LC-MS數(shù)據(jù)時間漂移校正的方法應(yīng)該對每一個有貢獻(xiàn)的m/z響應(yīng)進(jìn)行校正。然而，對于特定的一個色譜流出時間點，其對應(yīng)的m/z響應(yīng)信號有很多個，而其中真正的目標(biāo)分析物信號卻只占小部分，因此，在運用校正方法之前，必須對這些質(zhì)譜信號進(jìn)行篩選，選擇出高質(zhì)量的質(zhì)譜信號后再進(jìn)行校正。為此，“組分檢測算法”［17］的變量選擇方法被運用到對質(zhì)譜數(shù)據(jù)的篩選中。該算法具有計算時間快，對色譜峰形影響小等特點，與色譜領(lǐng)域所運用的 DTW、PTW 和COW算法相結(jié)合，可廣泛用于蛋白質(zhì)組學(xué)LC-MS的時間漂移校正。

結(jié)合前文總結(jié)的兩類校正方法的特點，本文最終選用Progenesis LC-MS軟件的算法，篩選出大量不同的色譜峰，并對所有色譜峰進(jìn)行校正，之后，從對齊的多次實驗色譜圖中再次檢測特征峰，并生成可用于搜庫的.mgf文件。通過Mascot軟件完成搜庫后，再將獲得的.xml文件導(dǎo)入Progenesis LC-MS軟件，進(jìn)行后續(xù)的分析處理。

2.1.3 其他譜圖校正方法

除了上文提到的以及我們最終選用的方法外，Aebersold 等［18］與 Escher等［19］采用 iRT(i-rentention time)的方法進(jìn)行了校正。他們選取了一系列被稱為iRT肽段的標(biāo)準(zhǔn)肽段(見表2)作為參照加入實驗樣品中，以此對樣品肽段流出峰進(jìn)行校正。對于在兩個iRT肽段間流出的肽段x，其iRT值計算方法為:iRTx=［(RTx－RT1)/(RT2－RT1)］×100。

表2 iR T肽段的序列與對應(yīng)iR T值Table 2 iR T-peptide sequences and corresponding iR T values

同一條肽段在不同實驗中經(jīng)過換算后得到的iRT值是相同的，那么，只要選定一次實驗的保留時間計算得到該肽段的iRT值，其他實驗中的該肽段流出峰保留時間就可以匹配上去，最終達(dá)到校正和對齊的效果。但是，由于11條iRT肽段將色譜圖分割成了10個區(qū)間，導(dǎo)致譜圖的校正對齊必須在分割后的區(qū)域內(nèi)分別完成，因此，我們最終并沒有選擇該方法。事實上，iRT的方法在很多時候都被用于保留時間的預(yù)測以及質(zhì)譜多反應(yīng)檢測(MRM)中。

2.2 利用Progenesis LC-MS軟件的校正結(jié)果

2.2.1 預(yù)校正結(jié)果的分析

本文中，我們首先對樣品Ⅰ和樣品Ⅱ的各6個餾分分別進(jìn)行第二維反相色譜分離，再進(jìn)入質(zhì)譜，連續(xù)進(jìn)行三次串級掃描，共計得到36個.wiff文件，總大小約400 G。進(jìn)而，我們選取樣品Ⅰ的第四餾分進(jìn)行了預(yù)校正分析。

對于任何一次HPLC-MS/MS實驗數(shù)據(jù)，都可以得到一系列可視化圖(如圖1)。圖1a的橫坐標(biāo)與縱坐標(biāo)分別為m/z值與保留時間，圖中點的顏色深淺代表對應(yīng)的m/z與保留時間的色譜峰強度;圖1b為最常見的總離子流圖。我們將樣品Ⅰ第四餾分的3次重復(fù)進(jìn)樣結(jié)果作了校正計算，圖2為樣品Ⅰ第四餾分的第二次與第三次重復(fù)進(jìn)樣譜圖校正前后的情況。從圖中可以看出，幾乎所有的流出峰都得到了比較良好的校正與對齊(見圖2b)。

圖1 樣品Ⅰ第四餾分第二次進(jìn)樣的(a)離子強度圖與(b)總離子流圖Fig.1 (a)Ion intensity map and(b)total ion chromatogram of the 2nd injection for the 4th fraction of sampleⅠ

圖2 樣品Ⅰ第四餾分第二次進(jìn)樣與第三次進(jìn)樣(a)校正前與(b)校正后的總離子流圖比較Fig.3 Comparison of total ion chromatograms of the 2nd and the 3rd injections for the 4th fraction of sampleⅠ(a)before alignment and(b)after alignment

將3次重復(fù)實驗的譜圖進(jìn)行校正對齊后，我們分別計算了它們之間的譜圖相似率(見表3)。由預(yù)校正相似率結(jié)果可知，在譜圖校正方面，我們采用的策略是可行的。因此，我們將該方法運用到了兩個樣品(Ⅰ和Ⅱ)總共12個餾分的36次實驗數(shù)據(jù)的批量處理中。

表3 樣品Ⅰ第四餾分3次重復(fù)進(jìn)樣之間的譜圖相似率Table 3 Similarities among three repeat injections of the 4th fraction in sampleⅠ

2.2.2 通過QconCAT標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)檢驗譜圖校正

在樣品處理過程中，我們在兩種不同藥物刺激的HUVEC樣品中等量加入了QconCAT標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。因此，可以通過對QconCAT標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的鑒定來考察譜圖校正的情況。

將校正后的譜圖文件導(dǎo)出為.mgf文件，然后，使用Mascot軟件進(jìn)行MS/MS搜索，使用QconCAT標(biāo)準(zhǔn)蛋白庫，肽段誤差允許為10 ppm，串級質(zhì)譜誤差允許為1 Da。將搜庫結(jié)果生成.xml文件，并導(dǎo)入Progenesis LC/MS軟件，該軟件將自動參考譜圖搜索結(jié)果把譜圖文件中的已鑒定肽段流出峰挑選出并生成列表。

最后，我們將樣品Ⅰ和Ⅱ各6個餾分的處理結(jié)果按照不同的重復(fù)次數(shù)進(jìn)行合并，得到了樣品Ⅰ及樣品Ⅱ總鑒定QconCAT標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)數(shù)的3次重復(fù)文件，分別標(biāo)記為Ⅰ-R1、Ⅰ-R2、Ⅰ-R3、Ⅱ-R1、Ⅱ-R2和Ⅱ-R3。對于這6個新生成的文件，我們將它們各自鑒定到的QconCAT標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)作圖進(jìn)行兩兩比較，對作比較的兩個文件中鑒定到的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的保留時間進(jìn)行線性擬合處理，得到相關(guān)系數(shù)(R)。

通過相關(guān)系數(shù)的“熱圖”可以直觀地發(fā)現(xiàn):兩種不同藥物刺激的樣品中，鑒定到的QconCAT標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相關(guān)系數(shù)在0.9附近，而同一樣品的重復(fù)進(jìn)樣之間相關(guān)系數(shù)都在0.98以上(見圖3)。推測造成這種結(jié)果的原因，主要為DMSO和MLN兩種不同的刺激使得HUVEC細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生了變化，而在不同的復(fù)雜體系背景下，蛋白質(zhì)的酶解肽段之間會發(fā)生互相干擾，影響到保留時間甚至是峰強度。因此，依靠譜圖校正的方法，我們在今后的研究中將會把肽段互相影響的因素作為研究方向。

圖3 樣品Ⅰ和Ⅱ所有重復(fù)實驗中QconCAT標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)鑒定的相關(guān)系數(shù)的熱圖Fig.3 Thermograph for correlation coefficients of identified QconCAT standard proteins among three repeat injections of sampleⅠandⅡ

2.2.3 HUVEC細(xì)胞中蛋白質(zhì)的定性、定量結(jié)果比較

最后，我們將校正前后的實驗數(shù)據(jù)在Mascot軟件中重新進(jìn)行了搜庫，使用Swissprot標(biāo)準(zhǔn)蛋白庫，肽段誤差允許為10 ppm，串級質(zhì)譜誤差允許為1 Da。對未進(jìn)行譜圖校正而直接進(jìn)行搜庫的結(jié)果統(tǒng)計處理后，顯示從DMSO處理的HUVEC細(xì)胞中鑒定到了6 535個蛋白質(zhì)，從MLN處理的HUVEC細(xì)胞中鑒定到了6 925個蛋白質(zhì)。

經(jīng)過譜圖校正之后，DMSO和MLN處理的HUVEC細(xì)胞分別鑒定到了8 089個和8 094個蛋白質(zhì)(見圖4)。蛋白質(zhì)的鑒定數(shù)量平均提高了近1 000個左右，說明我們的校正方法可以提高復(fù)雜體系中蛋白質(zhì)的鑒定率。

此外，我們還對DMSO和MLN刺激的HUVEC細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行了依靠譜圖計數(shù)的相對定量分析［20，21］，在 DMSO 刺激的 HUVEC 細(xì)胞中得到了6 308個蛋白質(zhì)，而MLN刺激的細(xì)胞中得到了6 873個蛋白質(zhì)，我們以兩倍比值差異進(jìn)行了兩個組分的差異分析，相比于DMSO刺激的細(xì)胞，MLN刺激的HUVEC細(xì)胞中有930個蛋白質(zhì)上調(diào)，274個蛋白質(zhì)下調(diào)(見圖5)。

2.3 存在的問題

圖4 譜圖經(jīng)校正后的DMSO與MLN刺激的HUVEC細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果Fig.4 Protein identification results in HUVEC treated with DMSO and MLN after spectrum alignment

圖5 DMSO和MLN刺激導(dǎo)致的HUVEC細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的差異Fig.5 Differential expression of proteins in HUVEC treated with DMSO or MLN

該方法的問題主要存在于低質(zhì)荷比范圍發(fā)生的質(zhì)量偏移。在預(yù)校正分析的樣品Ⅰ的兩次重復(fù)中，我們把譜峰校正、合并后，放大低質(zhì)荷比端，結(jié)果發(fā)現(xiàn):兩次實驗的質(zhì)荷比無法完全重現(xiàn)(見圖6上圖)，而中等質(zhì)荷比端則沒有發(fā)現(xiàn)此問題(見圖6下圖)。目前解決該問題的方法是進(jìn)行人工修正，暫時還沒有軟件自動校正的方法，這也是下一步需要研究關(guān)注的內(nèi)容。

3 結(jié)論

本文通過對不同刺激的HUVEC細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)展并檢驗了一種譜圖校正流程。該流程首先對復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行甲基化和雙酶解，并加入QconCAT標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)作為參照，然后通過高效液相色譜-串級質(zhì)譜進(jìn)行分離鑒定，最后通過Progenesis LC/MS軟件和Mascot軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行校正和分析。譜圖相似度的比較及對QconCAT標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)參照物的鑒定結(jié)果都證明了該流程比起其他方法更加快捷而有效，并且擁有高通量高靈敏度的優(yōu)點。

圖6 低質(zhì)荷比區(qū)域(上圖)與中等質(zhì)荷比區(qū)域(下圖)的離子強度圖Fig.6 Ion intensity maps of low m/z zone(up)and medium m/z zone(down)

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