張曉江，何 敏，劉建芳，萬 龍，楊 萍

(1吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，長春130033;2上海交通大學(xué)仁濟(jì)醫(yī)院)

急性心肌梗死后，梗死區(qū)域的心肌細(xì)胞失去功能，心臟的泵血功能受損可發(fā)生心力衰竭。研究發(fā)現(xiàn)，c-kit+干細(xì)胞可以改善心臟功能，但心臟中的ckit+細(xì)胞數(shù)量較少，不能完全阻止心力衰竭的發(fā)生。而骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BM-MNCs)來源的c-kit+細(xì)胞經(jīng)心肌注射或血管內(nèi)注射可修復(fù)梗死的心肌。2013年6～10月，我們觀察了急性心肌梗死小鼠BMMNCs中c-kit+干細(xì)胞的比例變化及細(xì)胞增殖核抗原(ki67)表達(dá)水平，探討急性心肌梗死后小鼠骨髓c-kit+干細(xì)胞的動(dòng)員及意義。

1 材料與方法

1.1 材料 8周的野生型純合子C57BL/6小鼠10只，體質(zhì)量22～25 g。TTC;Hanks平衡鹽溶液(HBSS);牛血清白蛋白(BSA);胎牛血清(FBS);磷酸鹽緩沖液(PBS);0.02% 乙二胺四乙酸(EDTA);IMDM細(xì)胞培養(yǎng)基;4%多聚甲醛;Ficoll淋巴細(xì)胞分離液;RNA提取試劑盒;反轉(zhuǎn)錄及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒;瓊脂糖粉末Agrose;TAE電泳緩沖液;核酸染料GelGreen;驢血清原液;兔抗鼠c-kit抗體，鼠抗鼠細(xì)胞增殖核抗原(ki67)抗體，驢抗兔Alex488，驢抗鼠Cy3;DAPI細(xì)胞核染料;小鼠c-kit磁珠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 心肌梗死模型制備 將10只小鼠分為心梗組(8只)、對(duì)照組(2只)。于麻醉狀態(tài)下在左側(cè)第3、4肋間隙擠出心臟，心梗組結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支建立心肌梗死模型。對(duì)照組不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，其余操作與手術(shù)組相同。TTC染色后鏡下觀察，心肌組織出現(xiàn)白色提示梗死組織，即心肌梗死模型建立成功。

1.2.2 BM-MNCs分離、培養(yǎng)及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

1.2.2.1 BM-MNCs分離、培養(yǎng) 模型制備后第 3、7天，心梗組采用扭斷頸部各處死小鼠4只;對(duì)照組術(shù)后第7天處死。各組小鼠處死后，用剪刀和鑷子小心剝離肌肉，分離小鼠的股骨和脛腓骨，浸泡于HBSS中;用剪刀剪斷骨的兩端，暴露骨髓腔;然后用5 mL注射器吸取2%FBS/PBS溶液，換取1 mL注射器的針頭，插入骨髓腔，對(duì)準(zhǔn)無菌15 mL離心管，將骨髓細(xì)胞沖入帶有細(xì)胞過濾網(wǎng)的離心管中(每根骨用2.5 mL緩沖液左右即可基本沖下骨髓腔內(nèi)的細(xì)胞)。取沖洗出的骨髓液，加入Ficoll淋巴細(xì)胞，常溫下離心20 min，吸取中間云霧層于另一個(gè)15 mL離心管中;用PBS洗滌細(xì)胞，4℃離心5 min 2次，分離出BM-MNCs。配置10%FBS/IMDM培養(yǎng)基，將分離的BM-MNCs接種于96孔板，放置于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.2.2 BM-MNCs指標(biāo)檢測(cè) ①c-kit mRNA 表達(dá):采用RT-PCR法。將用淋巴細(xì)胞分離液分離的BM-MNCs，按照試劑盒提供的操作流程進(jìn)行操作，檢測(cè)心梗組第3、7天及對(duì)照組第7天的c-kit表達(dá)。②c-kit+細(xì)胞比例:采用流式細(xì)胞術(shù)。將心梗組第3、7天及對(duì)照組的BM-MNCs用染色緩沖液及封閉液重懸細(xì)胞，4℃離心5 min;用封閉液重懸細(xì)胞并分管，每管中加入相應(yīng)抗體1 μL，4℃或置冰上孵育30 min;加入冷PBS 1 mL，4℃離心洗滌1次;棄上清用適量PBS重懸后，冰上避光，BD Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測(cè)，并用C-Flow Plus1.0檢測(cè)并分析BMMNCs中c-kit+細(xì)胞的比例。③c-kit+細(xì)胞分選:采用磁珠分選術(shù)。將心梗組第3、7天及對(duì)照組的BMMNCs用染色緩沖液及封閉液重懸細(xì)胞，4℃ 離心5 min;加入染色緩沖液80 μL中將細(xì)胞充分混勻;加入20 μL抗小鼠c-kit磁珠，于細(xì)細(xì)胞懸液后，吹打混勻，4℃ 旋轉(zhuǎn)孵育15 min;添加染色緩沖液400 μL，將細(xì)胞懸液裝入平衡后的分離柱上過柱。用0.5 mL的染色緩沖液重復(fù)2次;收集1.5 mL的c-kit－細(xì)胞懸液。將分離柱與磁鐵分開后，添加染色緩沖液收集c-kit+細(xì)胞;收集到的c-kit+陽性細(xì)胞和c-kit－陰性細(xì)胞行細(xì)胞培養(yǎng)和后續(xù)檢測(cè)。④ckit+細(xì)胞陽性率:采用細(xì)胞免疫熒光染色法檢測(cè)對(duì)照組、心梗組第3、7天的BM-MNCs中c-kit+細(xì)胞的c-kit蛋白。將用4%多聚甲醛固定好的細(xì)胞，加0.4%Triton-X100破膜5～10 min，用血清封閉室溫30 min～1 h;對(duì)應(yīng)一抗用0.5%BSA/PBS稀釋抗體，4℃孵育過夜;孵育后，二抗用0.5%BSA/PBS稀釋抗體，用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，Nikon Eclipse Ti-S熒光倒置顯微鏡下觀察c-kit+細(xì)胞的c-kit陽性表達(dá)，用NIS-Elements軟件分析染色陽性細(xì)胞的情況，統(tǒng)計(jì)c-kit+細(xì)胞陽性率。⑤c-kit+細(xì)胞、c-kit－細(xì)胞增殖情況:采用細(xì)胞免疫熒光染色法，取心梗后組制模第3天的c-kit+細(xì)胞、c-kit－細(xì)胞，觀察并比較兩者的ki67表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 c-kit mRNA水平 心梗組 BM-MNCs中c-kit mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組;心梗后第3天和第7天時(shí)骨髓單個(gè)核細(xì)胞中c-kit mRNA水平升高，且第3天高于第7天。見圖1。

2.2 c-kit+細(xì)胞比例 對(duì)照組的 BM-MNCs中 ckit+細(xì)胞比例為 3.8%;心梗組第 3、7天分別為16.6%、6.8%。見圖 2。

圖1 兩組BM-MNCs中c-kit mRNA表達(dá)水平

圖2 兩組BM-MNCs中c-kit+細(xì)胞比例(流式細(xì)胞術(shù))

2.3 c-kit+細(xì)胞陽性率 對(duì)照組少量單個(gè)核細(xì)胞為c-kit+，陽性率為4.0%，心梗組第3、7天 c-kit+陽性率分別為20.4%、8.25%。從 BM-MNCs中用磁珠分選出的c-kit+細(xì)胞染色幾乎全部細(xì)胞呈陽性染色。

2.4 細(xì)胞增殖情況 c-kit+細(xì)胞及c-kit-細(xì)胞均有增殖現(xiàn)象存在，可見 c-kit+ki67+、c-kit+ki67-細(xì)胞群。心梗組第3天c-kit+細(xì)胞增殖更加活躍。見圖3。

圖2 兩組BM-MNCs中c-kit+細(xì)胞比例(流式細(xì)胞術(shù))

3 討論

急性心肌梗死后心臟泵血能力受到影響，梗死區(qū)域的心肌細(xì)胞由于缺血損傷而失去功能［1，2］。一直以來，哺乳動(dòng)物的心臟被認(rèn)為是一個(gè)終末分化器官［3］，而存在于心臟中的心肌細(xì)胞也被認(rèn)為是終末分化細(xì)胞，因心肌無法再生導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生［4］。因此，心肌梗死治療以恢復(fù)正常冠狀動(dòng)脈血流、挽救梗死的心肌細(xì)胞和最大限度修復(fù)心肌功能為目標(biāo)［5，6］。常用方法一般是藥物和介入治療。近年研究發(fā)現(xiàn)，以c-kit為細(xì)胞表面標(biāo)記物的心臟干細(xì)胞可以修復(fù)損傷心?。?，8］，但是心臟干細(xì)胞數(shù)量不足［9］。應(yīng)用其他組織來源的c-kit+細(xì)胞成為研究熱點(diǎn)［10］。骨髓干細(xì)胞具有與心臟干細(xì)胞類似的作用，成為新的選擇［11，12］。

研究表明，心肌梗死后心臟中的c-kit+細(xì)胞數(shù)量有所增加，且有約74%的c-kit+細(xì)胞來源于骨髓［13］，表明心肌梗死后骨髓中的c-kit+干細(xì)胞比例增加。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠急性心肌梗死后骨髓中的c-kit+干細(xì)胞的比例高于對(duì)照組，提示心梗后小鼠骨髓中c-kit+細(xì)胞水平對(duì)損傷產(chǎn)生反應(yīng)，應(yīng)激性增加;心梗組第 3、7天 c-kit+細(xì)胞分別為 16.6%、6.8%，提示急性心肌梗死后小鼠BM-MNCs中的ckit+干細(xì)胞比例呈應(yīng)激性增加，并且隨時(shí)間推移逐漸降低。由于心肌梗死造成的缺血損傷對(duì)骨髓起到了動(dòng)員作用，骨髓中大量增加的c-kit+干細(xì)胞執(zhí)行心肌修復(fù)功能。而急性期過后，在心梗后第7天時(shí)，c-kit+干細(xì)胞比例相對(duì)于第3天時(shí)有所下降，表明損傷應(yīng)激引起的骨髓動(dòng)員現(xiàn)象可能主要存在于心梗1周以內(nèi)，并且以第3天時(shí)最活躍。

骨髓中c-kit+細(xì)胞的比例高于對(duì)照組，可能歸因于c-kit+細(xì)胞的旺盛增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，心梗組第3天BM-MNCs中c-kit+干細(xì)胞數(shù)量多、應(yīng)激活躍，提示心梗后第3天BM-MNCs中c-kit+干細(xì)胞處于活躍的增殖狀態(tài)，而c-kit-細(xì)胞群存在增殖現(xiàn)象但是比例不多，提示心肌缺血損傷后骨髓的動(dòng)員主要針對(duì)c-kit+干細(xì)胞。

綜上所述，急性心肌梗死后，受到心肌缺血損傷的應(yīng)激影響，小鼠BM-MNCs中c-kit+細(xì)胞的比例增高，出現(xiàn)增殖現(xiàn)象。今后的研究應(yīng)針對(duì)提高c-kit+細(xì)胞增殖以增加c-kit+陽性細(xì)胞的數(shù)量和比例。

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