黃雋敏，雷 焦，舒克鋼，陳秀娟，聶 浩，龔 權(quán)

(長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北荊州434023)

橙皮苷(HDN)是橙皮素與蕓香糖形成的糖苷，為二氫黃酮衍生物。既往研究顯示HDN具有多種藥理活性，如抗炎、抗脂質(zhì)氧化、清除氧自由基［1，2］、抗腫瘤［3］、維持血管正常滲透壓、降血脂及保護(hù)心血管系統(tǒng)［4，5］等作用。Garg 等［6］研究發(fā)現(xiàn) HDN 有較強(qiáng)的抑制和改善急性炎癥反應(yīng)的抗炎活性作用。秦得安等［7］研究發(fā)現(xiàn)HDN對(duì)羥自由基有明顯的清除作用。Al-Ashaal等［8］研究發(fā)現(xiàn)橙皮苷對(duì)喉癌、宮頸癌、乳房癌和肝癌有顯著的抗腫瘤活性。近年來(lái)隨著對(duì)HDN藥效學(xué)研究的深入，HDN已成為藥物學(xué)研究的熱點(diǎn)。2012年3月～2013年2月，我們觀察了HDN對(duì)撲熱息痛(APAP)和四氯化碳(CCl4)導(dǎo)致的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:清潔級(jí)昆明小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，質(zhì)量合格證SCXK(鄂)2008-0004，分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，自然晝夜節(jié)律光照。藥品和試劑:HDN、APAP購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;CCl4購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司;羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心;甲醛購(gòu)自武漢市中天化工有限責(zé)任公司;橄欖油為市售食用油。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 急性肝損傷模型制作［9，10］將50只小鼠隨機(jī)分為正常組、APAP組、CCl4組、HDN+APAP組、HDN+CCl4組，每組各10只。HDN+APAP組和HDN+CCl4組用 HDN 懸濁液(0.1 mL/10 g，溶于0.5%CMC-Na中)500 mg/kg灌胃，其他各組分別用同體積的0.5%CMC-Na溶液灌胃，均1次/d，連續(xù)10 d。末次給藥2 h后禁食不禁水，APAP組和HDN+APAP組腹腔注射APAP溶液175 mg/kg，CCl4組和 HDN+CCl4組腹腔注射0.4%CCl40.1 mL/10 g誘導(dǎo)急性肝損傷;正常組腹腔注射同體積0.5%CMC-Na溶液。

1.2.2 觀察項(xiàng)目

1.2.2.1 血清ALT、AST、LDH 水平 制模16 h后，小鼠眼球取血0.5 ～1.0 mL，室溫靜置30 min，4 ℃3 000 r/min離心15 min，取上清液，采用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、AST、LDH水平。

1.2.2.2 肝指數(shù) 眼球取血后處死各組小鼠，迅速解剖肝臟，冷生理鹽水漂洗，濾紙吸干稱重，計(jì)算肝指數(shù)。肝指數(shù)=肝質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%。

1.2.2.3 肝臟病理改變 取肝右葉，用10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下(HE染色，400×)觀察肝臟病理組織學(xué)改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用F檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肝指數(shù)及血清ALT、AST、LDH水平比較見(jiàn)表1。

表1 各組肝指數(shù)及血清ALT、AST、LDH水平比較(±s)

表1 各組肝指數(shù)及血清ALT、AST、LDH水平比較(±s)

注:與正常組比較，△P ＜0.01;與 APAP組比較，*P ＜0.01，#P ＜0.05;與CCl4組比較，▲P ＜0.05，★P ＜0.01

組別 肝指數(shù)(%) ALT(U/L) AST(U/L) LDH(U/g)APAP 組 4.42 ±0.27△ 1 398.47 ±291.37△ 2 864.02 ±829.50△7 394.35 ± 953.49 HDN+APAP 組 3.91 ±0.19# 259.38 ± 74.87* 589.40 ±153.88* 4 064.49 ±1 008.00 CCl4組 4.40 ±0.13△ 1 392.11 ±265.66△ 3 007.19 ±989.09△ 7 876.54 ±1 437.43△HDN+CCl4組 4.09 ±0.15▲ 391.31 ±100.42★ 643.19 ±156.20▲ 4 420.32 ±1 100.85▲正常組 3.88 ±0.43 52.56 ± 10.74 154.49 ± 26.30 1 170.00± 283.97

2.2 各組肝組織病理學(xué)變化 大體觀察發(fā)現(xiàn)，正常組肝臟顏色紅潤(rùn)，被膜光滑，有光澤，邊緣銳利，質(zhì)軟而富有彈性。APAP組肝臟外觀腫大，顏色略黃，出現(xiàn)灰黃色點(diǎn)狀壞死灶，分布尚均勻，無(wú)光澤，質(zhì)地較脆。CCl4組肝臟外觀體積腫大，邊緣鈍而厚，色澤灰黃無(wú)光伴有黃褐色斑塊，均勻分布，個(gè)別肝臟可見(jiàn)明顯片狀淤血。HDN+APAP組及HDN+CCl4組肝臟顏色稍紅潤(rùn)，形態(tài)接近正常。光鏡下可見(jiàn)，正常組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝索排列整齊，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，大小均勻，無(wú)變性、壞死，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變(見(jiàn)圖1A)。APAP組肝細(xì)胞形態(tài)被破壞，可見(jiàn)明顯圍繞中央靜脈的大片狀壞死，肝細(xì)胞有不同程度的變性、壞死并伴大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖1B)。與APAP組比較，HDN+APAP組肝細(xì)胞索形態(tài)接近正常，肝細(xì)胞壞死程度明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少(見(jiàn)圖1D)。CCl4組肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)排列紊亂，肝細(xì)胞明顯腫脹、壞死，伴明顯組織充血和大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖1C);與CCl4組比較，HDN+CCl4組肝腫脹程度明顯減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞排列較整齊，壞死明顯減少，可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝組織炎癥明顯改善(見(jiàn)圖1E)。

圖1 各組肝臟病理學(xué)變化光鏡圖(HE×400)

3 討論

橙皮苷來(lái)源廣泛，價(jià)格低，易獲取，主要存在于天然植物陳皮、枳實(shí)、柑橘皮中，尤其在中藥陳皮中含量豐富［11］。橙皮苷具有多種藥理、營(yíng)養(yǎng)等價(jià)值活性，特別在醫(yī)藥領(lǐng)域其研究已涉及到心血管、內(nèi)分泌、抗癌、抗突變、免疫、抗菌消炎、抗衰老等諸多方面。近年來(lái)橙皮苷在醫(yī)藥、食品、運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)學(xué)等領(lǐng)域的研究日益深入，橙皮苷的化學(xué)成分及藥理藥效作用的進(jìn)一步明確，使得其開(kāi)發(fā)利用具有重大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

APAP是臨床常用的解熱鎮(zhèn)痛藥，過(guò)量使用或體內(nèi)蓄積時(shí)可以造成嚴(yán)重的肝損害［12］，其誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷動(dòng)物模型是臨床上篩選保肝藥物的常用模型之一。目前認(rèn)為APAP在體內(nèi)主要經(jīng)肝細(xì)胞色素P450代謝，生成毒性中間代謝產(chǎn)物N-乙酸—對(duì)苯醌亞胺(NAPQI)，其絕大部分與硫酸及葡葡糖醛酸結(jié)合，經(jīng)腎臟排出體外。當(dāng)APAP攝入量超過(guò)機(jī)體代謝限度時(shí)，NAPQI未能及時(shí)處理，就與肝細(xì)胞膜結(jié)合，引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞壞死和死亡，造成肝損傷［13］。CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷動(dòng)物模型也是一種經(jīng)典的篩選和研究肝炎治療藥物的病理模型［14］，具有操作簡(jiǎn)便、適用性廣和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。目前學(xué)者認(rèn)為CCl4進(jìn)入體內(nèi)后，通過(guò)肝細(xì)胞色素P450而產(chǎn)生肝毒性代謝產(chǎn)物，生成活潑的三氯甲基自由基(·CCl3)和氯自由基(·Cl)，這些自由基可使細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，使膜結(jié)構(gòu)和功能破壞，并抑制細(xì)胞膜和微粒體膜上鈣泵活性導(dǎo)致鈣內(nèi)流增加，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡和壞死，內(nèi)源性轉(zhuǎn)氨酶釋放到胞外［15］。APAP和CCl4引起的急性肝損傷均有通過(guò)肝細(xì)胞色素P450代謝而產(chǎn)生肝毒性產(chǎn)物導(dǎo)致肝細(xì)胞膜破壞造成肝細(xì)胞的損壞。但APAP引起藥物性肝損傷，而CCl4則導(dǎo)致化學(xué)性肝損傷，兩者損傷途徑及機(jī)制有一定的不同。所以探討橙皮苷對(duì)兩種不同損傷機(jī)制引起的肝損傷是否具有保護(hù)作用，具有一定的實(shí)驗(yàn)意義。ALT和AST存在于正常肝細(xì)胞內(nèi)，肝細(xì)胞受損時(shí)外排入血液，ALT活性主要反應(yīng)肝細(xì)胞損傷，AST可反映線粒體的受損程度［16］;LDH是一種糖酵解酶，它廣泛存在于肝臟、心臟等多種組織器官當(dāng)中。當(dāng)組織器官出現(xiàn)病理變化時(shí)，LDH就會(huì)釋放到血液中，是組織損傷的較敏感指標(biāo)之一，臨床上常用其活性來(lái)評(píng)定肝功能受損程度［17］。這三者是常用的判斷肝臟損傷程度的重要指標(biāo)。

本研究中，APAP模型組和CCl4模型組小鼠肝指數(shù)、血清ALT、AST、LDH的含量均明顯升高，與正常組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)，肝臟病理學(xué)切片肝細(xì)胞大片壞死，表明本研究成功建立APAP和CCl4所致急性肝損傷動(dòng)物模型。與APAP模型組和CCl4模型組相比，APAP+HDN組和CCl4+HDN組小鼠肝指數(shù)、血清的ALT、AST、LDH含量各有所降低(P＜0.01或P＜0.05)，病理組織學(xué)顯示肝損傷壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度均明顯減輕，表明HDN對(duì)APAP和CCl4引起的急性肝損傷均具有保護(hù)作用。

綜上所述，HDN對(duì)APAP和CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損害均有一定的保護(hù)作用。因APAP、CCl4造成小鼠急性肝損害的機(jī)制不同，HDN可能通過(guò)作用于肝細(xì)胞不同的代謝環(huán)節(jié)而發(fā)揮對(duì)肝臟的保護(hù)作用，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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