趙小麗，徐建偉，劉麗秋

(1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島266021;2青島市第八人民醫(yī)院;3青島大學(xué)附屬醫(yī)院)

糖尿病腎病是終末期腎臟病的常見原因。近年研究顯示，高糖環(huán)境可誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞—間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，可能在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［1，2］。足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的機(jī)制尚未明確，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)/Smad通路是介導(dǎo)轉(zhuǎn)分化的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。雷公藤甲素(TP)能明顯減少糖尿病鼠蛋白尿，減輕腎小球肥大及足細(xì)胞損傷，可以通過調(diào)節(jié)Smad信號途徑減輕腎臟纖維化程度［3］。2012年3月～2013年4月，我們觀察了TP對高糖刺激小鼠足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及Smad信號表達(dá)的影響，探討TP的腎臟保護(hù)作用及可能機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠永生化足細(xì)胞系MPC5由山東大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，山東大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)贈。TP由上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司提供，純度＞99%。RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清購自Hyclone公司，重組小鼠γ-干擾素購自Peprotech公司，Trizol試劑購自Invitrogen公司，引物由上海生工公司合成，RT-PCR試劑盒與SYBR Premix Ex Taq購自大連寶生物工程有限公司，兔抗Smad3、Smad7多克隆抗體購自Abcam公司，兔抗結(jié)蛋白(Desmin)抗體購自Santa Cruz公司，兔抗突觸極蛋白(Synaptopodin)抗體、兔抗GAPDH抗體和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購自北京博奧森公司。

1.2 足細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù) 參照文獻(xiàn)［4］方法培養(yǎng)足細(xì)胞。細(xì)胞復(fù)蘇后置于含10%胎牛血清、10 U/mL γ-干擾素、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，33℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。3 d后轉(zhuǎn)入不含γ-干擾素的10%胎牛血清1640培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)10～14 d，待細(xì)胞分化成熟后使用。將成熟的細(xì)胞以5×105/mL的密度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞融合至70% ～80%時(shí)，于無血清的培養(yǎng)液中饑餓24 h使細(xì)胞同步化。細(xì)胞分為五組，分別加入下列試劑:正常組加入D-葡萄糖5.5 mmol/L，高糖組加入D-葡萄糖30 mmol/L，TP低劑量組加入D-葡萄糖30mmol/L+TP 3 ng/mL，TP高劑量組加入D-葡萄糖30 mmol/L+TP 10 ng/mL，甘露醇組加入D-葡萄糖5.5 mmol/L+甘露醇24.5 mmol/L。各組干預(yù)時(shí)間均為48 h。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 Smad3、Smad7、Synaptopodin、Desmin mRNA表達(dá) 采用熒光定量PCR法。按照Trizol試劑說明書提取各組細(xì)胞總RNA，然后利用260 nm的吸光度測定OD值和RNA濃度，按照RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件:37℃ 15 min，85℃ 5 s。按照 SYBR Premix Ex Taq說明書Light Cycler Real Time PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為:95℃ 30 s預(yù)變性，然后95℃ 5 s，60℃ 30 s重復(fù)40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)2個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)無模板陰性對照。Smad3引物序列F:5'-GTCAACAAGTGGTGGCGTGTG-3'，R:5'-GCAGCAAAGGCTTCTGGGATAA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度150 bp。Smad7引物序列F:5'-TCCTGCTGTGCAAAGTGTTC-3'，R:5'-AGTAAGGAGGAGGGGGAGAC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度165 bp。Synaptopodin引物序列 F:5'-AGACGACAGTTTGGAGAGAAGG-3'，R:5'-GCTGGGATACAGAGTGGAGTAA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度255 bp。Desmin引物序列 F:5'-TGCAGCCACTCTAGCTCGTA-3'，R:5'-GACATGTCCATCTCCACCTG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度150 bp。GAPDH引物序列F:5'-CTCATGACCACAGTCCATGC-3'，R:5'-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長度201 bp。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，確定產(chǎn)物特異性。以GAPDH為內(nèi)參基因，以正常組為對照，采用2－△△CT法測定 Smad3、Smad7、Synaptopodin、DesminmRNA 相 對 表 達(dá) 量，ΔCt=(Ct目的基因－Ct管家基因)實(shí)驗(yàn)組－(Ct目的基因－Ct管家基因)正常組。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.2 Smad3、Smad7、Synaptopodin、Desmin 蛋白表達(dá) 采用Western blot法。收集各組細(xì)胞，提取蛋白于95℃變性5 min。取上清，各組蛋白和Marker分別上樣，10%SDS-聚內(nèi)烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉封閉后以兔抗 Smad3、Smad7、Synaptopodin、Desmin、GAPDH 多克隆抗體分別4℃孵育過夜(分別按1∶600、1∶600、1∶200、1∶500、1∶1 000 稀釋)。洗膜后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶8 000)室溫孵育1 h，ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)分析，Quantity One4.6.2掃描各組光密度值，以 Smad3、Smad7、Synaptopodin、Desmin 條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的光密度值比值代表各蛋白的相對表達(dá)量。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組 Smad3、Smad7、Synaptopodin、Desmin mRNA表達(dá) TP低劑量組、TP高劑量組 Smad3、Desmin mRNA表達(dá)低于高糖組(P＜0.05)，Smad7、Synaptopodin mRNA表達(dá)高于高糖組(P＜0.05)，正常組與甘露醇組相比，各因子表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.2 各組 Smad3、Smad7、Synaptopodin、Desmin 蛋白表達(dá) 與正常組比較，高糖組足細(xì)胞Smad3、Desmin表達(dá)增多、Smad7、Synaptopodin表達(dá)減少(P＜0.05)。TP低劑量組、TP高劑量組、甘露醇組足細(xì)胞Smad3、Desmin蛋白表達(dá)低于高糖組(P＜0.05)，Smad7、Synaptopodin蛋白表達(dá)高于高糖組(P＜0.05)，正常組與甘露醇組相比，各因子表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1、表2。

3 討論

蛋白尿不僅是糖尿病腎病的重要臨床特征，其持續(xù)存在也是加速糖尿病腎病進(jìn)展的危險(xiǎn)因素之一。足細(xì)胞作為腎臟濾過屏障的重要組成部分，其結(jié)構(gòu)和功能異常是蛋白尿發(fā)生的重要原因。近年研究顯示，腎小球?yàn)V過屏障結(jié)構(gòu)和功能的改變，尤其是足細(xì)胞及其相關(guān)蛋白的改變與蛋白尿的產(chǎn)生和發(fā)展密切相關(guān)，可能在糖尿病腎病的發(fā)生與進(jìn)展過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞在許多病理狀態(tài)下可以發(fā)生轉(zhuǎn)分化，出現(xiàn)間充質(zhì)標(biāo)志物α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Desmin、纖連蛋白(FN)等表達(dá)上調(diào)，發(fā)生轉(zhuǎn)分化的足細(xì)胞易于從基底膜上脫落，造成濾過屏障的不完整，導(dǎo)致蛋白尿的形成［5］。

表1 各組Smad3、Smad7、Synaptopodin及Desmin mRNA相對表達(dá)量比較(±s)

表1 各組Smad3、Smad7、Synaptopodin及Desmin mRNA相對表達(dá)量比較(±s)

注:與正常組比較，*P ＜0.05，△P ＞0.05;與高糖組比較，﹟ P ＜0.05

Smad3 Smad7 Synaptopodin Desmin正常組組別1.01 ±0.21 1.01 ±0.19 1.01 ±0.18 1.00 ±0.04高糖組 4.45 ±0.26* 0.28 ±0.06* 0.32 ±0.05* 4.27 ±0.16*TP低劑量組 3.14±0.14*﹟ 0.59±0.11*﹟ 0.45±0.11* 3.27±0.01*﹟TP高劑量組 1.73±0.15*﹟ 0.80±0.14*﹟ 0.67±0.17*﹟ 1.68±0.13*﹟甘露醇組 0.96±0.14△﹟ 1.03±0.15△﹟ 0.94 ±0.18△﹟ 1.07±0.05△﹟

圖1 各組足細(xì)胞Smad3、Smad7、Synaptopodin、Desmin蛋白表達(dá)

表2 各組Smad3、Smad7、Synaptopodin及Desmin蛋白表達(dá)比較(相對表達(dá)量，±s)

表2 各組Smad3、Smad7、Synaptopodin及Desmin蛋白表達(dá)比較(相對表達(dá)量，±s)

注:與正常組比較，*P ＜0.05，△P ＞0.05;與高糖組比較，﹟ P ＜0.05

Smad3 Smad7 Synaptopodin Desmin正常組組別0.20 ±0.02 0.79 ±0.07 0.78 ±0.09 0.35 ±0.03高糖組 0.77 ±0.10* 0.29±0.05﹡ 0.38±0.03﹡ 0.65±0.03﹡TP 低劑量組 0.57±0.02*﹟ 0.59±0.04*﹟ 0.49±0.02* 0.56±0.02*﹟TP 高劑量組 0.36±0.02*﹟ 0.64±0.05*﹟ 0.60±0.02*﹟ 0.47±0.06*﹟甘露醇組 0.23 ±0.04△﹟ 0.80±0.05△﹟ 0.83±0.07△﹟ 0.33±0.02△﹟

目前足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的機(jī)制尚未明確。TGFβ/Smad信號通路是介導(dǎo)腎臟纖維化最重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，TGFβ1通過結(jié)合并激活具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的跨膜受體，進(jìn)而催化其下游信號分子Smads磷酸化而發(fā)揮生物學(xué)作用［6，7］。糖尿病腎病時(shí)TGFβ1表達(dá)增加并激活其下游Smad2、Smad3，介導(dǎo)腎小管上皮轉(zhuǎn)分化及腎臟纖維化發(fā)展［8］。Samd7是TGFβ/Smad信號通路重要的負(fù)反饋抑制因子，可以通過拮抗 TGFβ/Smad通路而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用［9］。研究證實(shí)下調(diào) Smad3的表達(dá)及上調(diào)Smad7的表達(dá)可以抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化［10，11］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，體外給予高糖刺激可下調(diào)足細(xì)胞Smad7表達(dá)，促進(jìn)足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，提示Smad蛋白表達(dá)異?？赡苁亲慵?xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化的重要機(jī)制［12］。Synaptopodin是一種富含脯氨酸的肌動蛋白結(jié)合蛋白，表達(dá)于分化成熟的足細(xì)胞。Desmin是O-唾液酸糖蛋白家族成員，其大量表達(dá)提示足細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，高糖組足細(xì)胞Smad3、Synaptopodin mRNA及蛋白表達(dá)增多，Smad7、Desmin mRNA及蛋白表達(dá)減少，提示高糖刺激可以在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上調(diào)節(jié)足細(xì)胞Smad3表達(dá)，下調(diào)Smad7表達(dá)，并且使成熟足細(xì)胞標(biāo)志物Synaptopodin表達(dá)減少，而間充質(zhì)標(biāo)志物Desmin表達(dá)增多;正常組與甘露醇組相比，足細(xì)胞 Smad3、Smad7、Desmin、Synaptopodin表達(dá)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示高糖刺激而非高滲刺激可以影響足細(xì)胞Smad蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。

雷公藤具有免疫抑制、抗炎及抗腫瘤的作用，在多種腎小球疾病，如微小病變、局灶節(jié)段性腎小球硬化和膜性腎病的治療中顯示了獨(dú)特的功效。TP是雷公藤有效成分之一，對Heymann腎炎具有顯著的治療作用，能有效減少蛋白尿，減輕腎組織免疫損傷，促進(jìn)足細(xì)胞病變和裂孔膜蛋白結(jié)構(gòu)的修復(fù)［13］。研究表明TP可以通過抑制系膜細(xì)胞Smad3的表達(dá)及核轉(zhuǎn)位，上調(diào)Smad7，抑制TGFβ1誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞的增殖，減輕腎臟纖維化，還可以通過上調(diào)Ski，抑制 TGFβ1、Smad3 的表達(dá)，改善單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟纖維化，提示TP可以通過調(diào)節(jié)Smad蛋白的表達(dá)抑制腎臟纖維化過程。本研究發(fā)現(xiàn)，TP低劑量組、TP高劑量組足細(xì)胞Smad3、Desmin mRNA及蛋白表達(dá)均低于高糖組，Smad7、Synaptopodin mRNA及蛋白表達(dá)均高于高糖組，提示TP干預(yù)可以抑制高糖刺激誘導(dǎo)的Smad3、Smad7表達(dá)異常，部分恢復(fù)Synaptopodin表達(dá)，減少Desmin表達(dá)，從而調(diào)節(jié)足細(xì)胞TGFβ/Smad信號通路而抑制足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。

綜上所述，TP可以在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平抑制高糖刺激的足細(xì)胞Smad3表達(dá)，上調(diào)Smad7表達(dá)，并抑制足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，為TP應(yīng)用于臨床治療糖尿病腎病提供了理論依據(jù)。

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