馬 琨，郭建剛

(河南省洛陽正骨醫(yī)院，河南洛陽471002)

骨巨細(xì)胞瘤(GCTB)是常見且具有潛在惡性的骨腫瘤，大塊切除是其治療的理想方案，但其術(shù)后侵襲性生長(zhǎng)和復(fù)發(fā)率為40% ～50%，且易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。研究表明，原癌基因c-myc表達(dá)升高在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。腫瘤的演進(jìn)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管生成，c-myc可調(diào)控下游基因缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)［1］，促進(jìn)下游血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤血管形成，促進(jìn)實(shí)體腫瘤自身的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和化療耐藥［2］。目前，有的學(xué)者將c-myc和HIF-1α作為評(píng)估乳腺癌等實(shí)體瘤生物學(xué)行為和預(yù)后的標(biāo)志物［3］，但二者在GCTB組織中是否呈高表達(dá)、其表達(dá)是否與腫瘤進(jìn)展有關(guān)，國(guó)內(nèi)外報(bào)道甚少。為此，我們對(duì)c-myc、HIF-1α在GCTB組織中的表達(dá)及其與臨床、生物學(xué)行為的關(guān)系進(jìn)行了初步研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2006～2013年在我院行GCTB手術(shù)的80例患者的病理標(biāo)本，男54例、女26例，年齡18～60歲、平均48.3歲。病變位于股骨下端34例、脛骨上端25例、橈骨遠(yuǎn)端12例、橈骨近端4例、骶骨3例、骨盆2例，均經(jīng)臨床、病理、X線聯(lián)合檢查確診。Campanacci影像學(xué)分期為Ⅰ期18例，Ⅱ期34例，Ⅲ期28例;治愈65例，復(fù)發(fā)15例。除2例復(fù)發(fā)后失訪外，均獲隨訪，隨訪時(shí)間平均60個(gè)月。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)方法 取患者的GCTB組織蠟塊4 μm行連續(xù)切片，進(jìn)行免疫組化染色。主要步驟:腫瘤組織石蠟切片，58℃烤片過夜;常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化;檸檬酸鹽行高溫、高壓抗原修復(fù);3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，分別滴加c-myc、HIF-1α、CD34單克隆抗體，室溫孵育1 h;滴加生物素標(biāo)記二抗孵育15 min;DAB顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。免疫組化試劑均為福州邁新生物公司產(chǎn)品。

1.2.2 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) c-myc主要定位在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色。HIF-1α主要定位于細(xì)胞核，出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒樣物質(zhì)為陽性。高倍鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野觀察細(xì)胞數(shù)不少于200個(gè)。根據(jù)細(xì)胞核染色強(qiáng)度及染色細(xì)胞百分率進(jìn)行評(píng)分:①染色強(qiáng)度:基本不著色為0分，著淡黃色為1分，著棕黃色為2分，著棕褐色為3分。②陽性細(xì)胞所占百分率:≤5%為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為 3分，≥75%為4分。每張切片染色強(qiáng)度得分與陽性細(xì)胞百分率得分相乘為其最后得分，0～1分為陰性(－)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為陽性(++)，≥6分為強(qiáng)陽性(+++)。采用CD34單抗標(biāo)記新生血管內(nèi)皮，CD34陽性判斷為細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)著深棕色顆粒。微血管密度(MVD)計(jì)數(shù):GCTB內(nèi)任何一個(gè)孤立的棕黃色細(xì)胞或細(xì)胞簇均認(rèn)為是一條單獨(dú)血管，先在低倍視野內(nèi)找到腫瘤組織內(nèi)微血管最豐富區(qū)域，即腫瘤內(nèi)微血管的“熱點(diǎn)”，再于高倍視野下計(jì)數(shù)3個(gè)視野內(nèi)的微血管數(shù)目，取其平均值進(jìn)行分析。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較用單因素方差分析，多重比較用t檢驗(yàn)，等級(jí)資料比較行秩和檢驗(yàn)，HIF-1α、c-myc表達(dá)與MVD值行Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 c-myc、HIF-1α表達(dá)與 GCTB患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。c-myc陽性物質(zhì)主要表達(dá)于細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)，HIF-1α陽性物質(zhì)呈棕黃色顆粒狀，主要表達(dá)于細(xì)胞核。患者的c-myc、HIF-1α陽性表達(dá)率分別為55%(44/80)、50%(40/80)。

表1 c-myc、HIF-1α表達(dá)與GCTB患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系［例(%)］

2.2 HIF-1α表達(dá)強(qiáng)度與MVD計(jì)數(shù)的關(guān)系 CD34陽性表達(dá)定位于腫瘤間質(zhì)小血管及微血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中，CD34陽性細(xì)胞可見瘤組織中的微血管為單個(gè)或成簇出現(xiàn)。HIF-1α表達(dá)陰性、陽性者GCTB組織中的 MVD 計(jì)數(shù)分別為(28.47 ±4.31)、(46.85 ±7.72)個(gè)/mm2，其中 HIF-1α 表達(dá)(－ )、(+)、(++)、(+++)者分別為 40、13、16、11 例，其 GCTB 組織中的 MVD 計(jì)數(shù)分別為(28.47 ±4.31)、(37.29 ±7.62)、(48.58 ± 6.97)、(54.69 ± 8.59)個(gè)/mm2;HIF-1α表達(dá)(++)、(+++)者的 MVD數(shù)目高于(－)、(+)者，P 均 ＜0.05;HIF-1α 表達(dá)強(qiáng)度與MVD 值呈高度正相關(guān)(r=0.996，P ＜0.01)。

2.3 HIF-1α、c-myc表達(dá)強(qiáng)度與GCTB患者預(yù)后的關(guān)系 見表2。

表2 HIF-1α、c-myc表達(dá)強(qiáng)度與GCTB患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，GCTB經(jīng)過外科手術(shù)治療后仍有20% ～50%的復(fù)發(fā)率，部分患者可發(fā)生肺轉(zhuǎn)移［4］。近年來，評(píng)估GCTB生物學(xué)行為和判斷其預(yù)后的可靠腫瘤標(biāo)志物成為臨床研究的熱點(diǎn)。c-myc蛋白是由myc家族編碼的轉(zhuǎn)錄因子，人類c-myc基因定位于Ⅷ染色體上，由3個(gè)外顯子及2個(gè)內(nèi)含子組成。Ⅰ外顯子只起調(diào)節(jié)作用，Ⅱ、Ⅲ外顯子是轉(zhuǎn)譯區(qū)，編碼包含439個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。該基因表達(dá)在細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控中發(fā)揮雙向作用，既可刺激細(xì)胞增殖，也可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。李灼日等［5］研究表明，c-myc表達(dá)特征可反映膽管癌的生物學(xué)行為和惡性程度。林稱意等［6］研究表明，c-myc表達(dá)強(qiáng)度是判斷食管癌細(xì)胞過度分化及術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究顯示:①c-myc在GCTB組織中的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤大小及發(fā)病部位無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示上述參數(shù)不能作為判斷GCTB侵襲及復(fù)發(fā)的指標(biāo)。②隨著Companacci分期逐漸增高，c-myc表達(dá)逐漸升高，其中Ⅰ期與Ⅱ期、Ⅰ期與Ⅲ期比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且復(fù)發(fā)者的陽性表達(dá)率高于治愈者;提示c-myc可促進(jìn)GCTB細(xì)胞增殖，并與腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有密切關(guān)系。有學(xué)者對(duì)骨肉瘤患者的組織標(biāo)本進(jìn)行c-myc原位雜交并作臨床隨訪，發(fā)現(xiàn)c-myc表達(dá)陽性率為80%，其中肺轉(zhuǎn)移死亡者的陽性率高于存活3年以上者;提示c-myc過度表達(dá)與間葉來源腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，其在分化差的區(qū)域表達(dá)較高，而在分化較好的區(qū)域表達(dá)則相反［7］。

實(shí)體性腫瘤的生長(zhǎng)依賴于血管的生成，豐富的血管可為其提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)條件，但腫瘤細(xì)胞增殖過快而血運(yùn)無法滿足其生長(zhǎng)需求時(shí)，就會(huì)形成局部缺氧的微環(huán)境，在腫瘤內(nèi)部出現(xiàn)為耐受缺氧而表達(dá)的HIF。HIF是一種雙聚復(fù)合體，有 HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α三個(gè)亞型，由不同的基因編碼。低氧時(shí)HIF-1α與缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，可提高VEGF mRNA的穩(wěn)定性，促進(jìn)VEGF表達(dá)上調(diào)，增加供血、供氧、供能，改善惡性腫瘤因組織增生過快造成的局部組織缺氧及供能與耗能失衡，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［8］。另外，某些化療藥在氧分壓正常時(shí)也促進(jìn)HIF-1α累積，使細(xì)胞耐藥［9］。本研究顯示:①HIF-1α在GCTB組織中的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤大小及發(fā)病部位無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示上述參數(shù)不能作為判斷GCTB侵襲及復(fù)發(fā)的指標(biāo)。②HIF-1α陽性率為50%，Companacci影像學(xué)分期越高，其HIF-1α陽性率越高，且復(fù)發(fā)者的陽性率高于治愈者。提示HIF-1α表達(dá)強(qiáng)度與GCTB細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。HIF-1α可能通過以下途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)行為:①HIF-1α與缺氧反應(yīng)元件中的共有序列結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上增加VEGF表達(dá)，提高VEGF mRNA的穩(wěn)定性，上調(diào)VEGF蛋白表達(dá)水平，增加供血、供氧、供能，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移［10］;②抑制成骨細(xì)胞分化;③誘導(dǎo)其下游因子 IL-6和 TNF-α，通過 OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)加速破骨細(xì)胞生成，促進(jìn)骨吸收和骨破壞［11］。

HIF-1α是c-myc的下游調(diào)節(jié)物，c-myc通過調(diào)控HIF-1α參與腫瘤新生血管形成，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移發(fā)揮促進(jìn)作用［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，c-myc、HIF-1α與CD34在GCTB組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，復(fù)發(fā)者的c-myc、HIF-1α雙陽性表達(dá)率高于治愈者。由此可見，HIF-1α與c-myc存在調(diào)節(jié)機(jī)制，兩者在促進(jìn)GCTB進(jìn)展中可能發(fā)揮協(xié)同作用，可作為評(píng)估GCTB生物學(xué)行為和判斷患者預(yù)后的重要指標(biāo)。

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