陸佳偉，繆惠東，顧紅星，薛亞崗

(蘇州大學(xué)附屬張家港市第一人民醫(yī)院，江蘇蘇州215600)

肢體缺血再灌注損傷(IRI)是較常見的病理變化，其不僅加重局部組織損傷，而且可致心、腦、肝臟等遠(yuǎn)隔器官功能障礙［1］。近年來，缺血后處理在IRI保護(hù)機(jī)制中的作用逐漸受到人們重視，但其對(duì)再灌注導(dǎo)致的遠(yuǎn)隔器官損傷有無保護(hù)作用，目前少見這方面的研究。2012～2013年，我們觀察了重組人促紅細(xì)胞生成素(rHu-EPO)后處理對(duì)肢體缺血再灌注(RI)誘發(fā)大鼠腎損傷的影響，并探討核轉(zhuǎn)錄因子-κB 亞基 p65 親和肽(NF-κB p65)、TNF-α 在其中的作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量240～250 g(江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、TNF-α的ELISA試劑盒(南京建成生物研究所提供)。兔NF-κB p65多克隆抗體、DAB顯色試劑盒、即用型SABC染色試劑盒(武漢博士德生物公司提供)。rHu-EPO購自成都地奧公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 將30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、肢體IR組、rHu-EPO后處理組(rHu-EPO組)各10只。大鼠禁食 12 h，自由進(jìn)水。參照文獻(xiàn)［2，3］方法制作大鼠肢體缺血模型，先行戊巴比妥鈉腹腔麻醉，然后在其雙后肢中、上1/3處用止血帶結(jié)扎10 min，結(jié)扎遠(yuǎn)端皮膚呈絳紫色為后肢缺血成功;松開止血帶后遠(yuǎn)端皮膚恢復(fù)紅潤為后肢再灌注成功。肢體IR組在雙后肢結(jié)扎缺血4 h后松開止血帶，恢復(fù)血流再灌注2 h取標(biāo)本;假手術(shù)組松開止血帶不阻斷血流，其余步驟同肢體IR組;rHu-EPO組在雙后肢結(jié)扎4 h后、再灌注前腹腔注射rHu-EPO 3 000 U/kg，恢復(fù)血流再灌注2 h后取標(biāo)本。

1.2.2 標(biāo)本留取 再灌注2 h后，迅速打開3組大鼠腹腔，于腹主動(dòng)脈處取血4 mL后處死動(dòng)物。將血液置于抗凝管內(nèi)靜置4 h，以4 500 r/min離心15 min，分離血清置于－20℃保存。分離3組右腎周圍結(jié)締組織，以4℃冰生理鹽水沖洗表面血液，將右腎縱剖成兩份，一份制備成10%的組織勻漿，一份用4%多聚甲醛固定后行石蠟切片，用于病理分析及腎組織NF-κB p65檢測(cè)。

1.2.3 各指標(biāo)檢測(cè) ①腎功能:采用化學(xué)比色法檢測(cè)血清BUN及Cr。②腎組織氧化損傷和抗氧化指標(biāo):采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD活性，硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)TNF-α。③組織學(xué)變化:將石蠟切片常規(guī)切片4 μm厚，行HE染色后，在光鏡下觀察組織學(xué)改變。④NF-κB p65蛋白表達(dá):采用免疫組化法。將標(biāo)本切片先后行脫蠟至水化、小牛血清封閉、滴加一抗、孵育、加二抗、加SABC工作液、DAB顯色，行復(fù)染、透明、封固后在光鏡下進(jìn)行觀察，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)有棕色顆粒沉積為NF-κB p65表達(dá)陽性。以已知陽性片作為陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。染色標(biāo)記強(qiáng)度用光密度值(OD)表示。以上檢測(cè)步驟均嚴(yán)格按照其試劑盒說明書要求進(jìn)行。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用q檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組血清BUN、Cr比較 見表1。

表1 3組血清 BUN、Cr比較(±s)

表1 3組血清 BUN、Cr比較(±s)

注:與假手術(shù)組比較，▲P ＜0.05;與肢體 IR組比較，△P ＜0.05

組別 n BUN(mmol/L) Cr(μmol/L)10 7.05 ±1.03 62.53 ±3.49肢體 IR 組 10 15.13±0.95▲ 85.28±5.50▲rHu-EPO 組 10 10.38±0.97▲△ 78.44±3.18假手術(shù)組▲△

2.2 3組腎組織中的 SOD、MDA、TNF-α比較 見表2。

表2 3組腎組織中的 SOD、MDA、TNF-α比較(±s)

表2 3組腎組織中的 SOD、MDA、TNF-α比較(±s)

注:與假手術(shù)組比較，▲P ＜0.05;與肢體 IR組比較，△P ＜0.05

組別 n SOD(U/mg) MDA(nmol/mg) TNF-α(pg/mL)10 105.74 ±3.04 2.09 ±0.35 1.20 ±0.68肢體 IR 組 10 81.33±4.12▲ 4.18±0.41▲ 3.12±0.79▲rHu-EPO 組 10 92.81±3.55▲△ 3.27±0.38▲△ 2.39±0.61假手術(shù)組▲△

2.3 3組腎組織病理變化 假手術(shù)組腎小管及間質(zhì)組織結(jié)構(gòu)基本正常;肢體IR組腎小管上皮細(xì)胞腫脹，細(xì)胞管型形成，大量炎性細(xì)胞浸潤，部分細(xì)胞變性壞死，細(xì)胞崩解;rHu-EPO組腎小管上皮細(xì)胞輕度水腫、空泡變性，少見管型，少量炎細(xì)胞浸潤，個(gè)別管腔輕度壞死。

2.4 3組腎組織中的NF-κB p65表達(dá)比較 在高倍鏡下，假手術(shù)組腎小球中無NF-κB p65表達(dá)，腎小管上皮細(xì)胞中有少量NF-κB p65表達(dá)。肢體IR組腎小管上皮細(xì)胞中NF-κB p65有明顯表達(dá)，腎小球中無明顯表達(dá)。rHu-EPO組腎小管上皮細(xì)胞中的NF-κB p65表達(dá)較假手術(shù)組增多、肢體IR組減少。假手術(shù)組、肢體IR組、rHu-EPO組腎組織中NF-κB p65 表達(dá)的 OD 值分別為 0.048、0.472、0.306;肢體IR組的NF-κB p65表達(dá)明顯，rHu-EPO組高于假手術(shù)組、但低于肢體IR組(P均＜0.05)。

3 討論

腎臟血液灌流豐富，對(duì)缺血缺氧極為敏感。本研究通過制備大鼠雙下肢I(xiàn)R模型，發(fā)現(xiàn)肢體IR組腎小管上皮細(xì)胞腫脹、細(xì)胞管型形成、大量炎性細(xì)胞浸潤，部分細(xì)胞變性、壞死、崩解;同時(shí)血清BUN、Cr明顯升高。提示肢體RI可致大鼠一定程度的腎損傷。

研究發(fā)現(xiàn)，大鼠肢體發(fā)生RI致腎損傷時(shí)，其機(jī)體的神經(jīng)體液等調(diào)節(jié)失衡，導(dǎo)致不正常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞功能異常，引發(fā)一系列凋亡事件和細(xì)胞壞死［4，5］。近年研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB 過度活化是 IRI的重要原因［6］。NF-κB是具有多向性轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)節(jié)因子，廣泛存在于真核細(xì)胞中，在基因表達(dá)的啟動(dòng)和關(guān)閉過程中起重要作用［7］。靜息狀態(tài)下，NF-κB多以p50、p65二聚體及其抑制蛋白ⅠκB相結(jié)合的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中［8］。內(nèi)源性或外源性刺激ⅠκB發(fā)生磷酸化和降解使NF-κB移位，可能是啟動(dòng)急性炎癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。TNF-α是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的重要炎癥介質(zhì)，它通過直接細(xì)胞毒作用及收縮血管而降低血流，聚集炎性細(xì)胞致細(xì)胞凋亡，造成組織損傷［9］;同時(shí)作為細(xì)胞外刺激信號(hào)激活NF-κB，形成瀑布效應(yīng)及惡性循環(huán)，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，最終加重再灌注組織及遠(yuǎn)隔器官損傷。Omoya等［10］研究表明，氧自由基可使ⅠκB減少，核內(nèi)NF-κB活性增強(qiáng)。組織發(fā)生RI時(shí)，首先使氧自由基生成、釋放增加，激活 NF-κB，然后促進(jìn)TNF-α等炎性因子轉(zhuǎn)錄。IRI后可產(chǎn)生大量氧自由基，引發(fā)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)過氧化生成MDA，其水平高低既直接反映組織內(nèi)的脂質(zhì)過氧化程度，又間接反映組織細(xì)胞受自由基攻擊的損傷程度［11］。SOD作為重要的抗氧化酶，其活性高低反映組織清除氧自由基的能力［12］。

本研究顯示，假手術(shù)組腎組織及間質(zhì)組織結(jié)構(gòu)基本正常;肢體IR組腎小管上皮細(xì)胞腫脹，大量炎性細(xì)胞浸潤，部分細(xì)胞變性、壞死，腎組織中的MDA升高、SOD活性下降、TNF-α及NF-κB p65表達(dá)明顯增加，提示NF-κB p65表達(dá)、TNF-α水平與大鼠肢體RI誘發(fā)腎損傷有密切關(guān)系。肢體RI致大量氧自由基產(chǎn)生，引起大鼠自身組織損傷，同時(shí)通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)隔的腎組織激活NF-κB p65，促進(jìn)TNF-α等炎癥因子表達(dá)，可能是組織再灌注后引起遠(yuǎn)隔器官損傷的機(jī)制之一。rHu-EPO是由缺氧誘導(dǎo)因子家族誘導(dǎo)產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子超家族成員，近年研究發(fā)現(xiàn)，其生物學(xué)作用包括促進(jìn)紅系祖細(xì)胞增殖、分化和成熟，并有抗氧化應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng)、抗凋亡和促進(jìn)血管新生等作用［13～15］。本研究采用 rHu-EPO對(duì)肢體RI進(jìn)行后處理，發(fā)現(xiàn)rHu-EPO組較肢體IR組的血清MDA降低，腎組織中的SOD活性增強(qiáng)，TNF-α及NF-κB p65表達(dá)降低，腎功能及腎小管上皮細(xì)胞水腫、變性、壞死好轉(zhuǎn)，表明rHu-EPO對(duì)大鼠肢體RI誘發(fā)的腎損傷有保護(hù)作用。在肢體RI導(dǎo)致腎損傷的過程中，rHu-EPO減少氧自由基生成及其引發(fā)的脂質(zhì)過氧化，抑制NF-κB p65表達(dá)，使炎癥因子TNF-α產(chǎn)生相應(yīng)減少，可能是其保護(hù)腎組織IRI的重要機(jī)制之一。本研究為臨床治療和預(yù)防組織RI引發(fā)的多臟器損傷提供了新的思路。

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