張海娟，楊玉秀

(石家莊市第四醫(yī)院，石家莊050017)

自1971年Friend等發(fā)現(xiàn)二甲基亞砜可誘導小鼠紅白血病細胞分化為成熟紅細胞而產(chǎn)生血紅蛋白以來，誘導分化作為一種治療惡性腫瘤的有效方法引起了人們的重視。維甲酸類化合物是常用的誘導分化劑，對多種惡性腫瘤具有誘導分化、抑制增殖、誘導腫瘤細胞凋亡的作用［1］。全反式維甲酸(ATRA)是維生素A的天然衍生物及生物活性形式，能誘導多種腫瘤細胞分化或抑制腫瘤細胞增殖［2］。為探討ATRA對卵巢癌SKOV3細胞的抑制增殖和誘導分化作用，2009年1～12月，我們進行了相關研究?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 卵巢癌SKOV3細胞株購自北京大學人民醫(yī)院。RPMI-1640培養(yǎng)基購自GIBCO BRL公司;MTT購自Singma公司。鼠抗人分化相關基因1(NDRG1)單克隆抗體購自DBS公司;SP試劑盒和DAB顯色劑購自北京中山生物公司。ATRA購自Sigma公司;酶標儀購自Absystems Dragon公司;流式細胞分析儀購自BD Facscalibur公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 以1×10－6mol/L的ATRA處理人卵巢癌 SKOV3細胞 1、2、3、5 d為實驗組，不加ATRA處理細胞為對照組。將SKOV3細胞置于RPMI-1640培養(yǎng)基中，加入10%的新生牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素。細胞培養(yǎng)用50 mL培養(yǎng)瓶，在5%CO2、37℃飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)，細胞生長達匯合狀態(tài)時，用0.04%EDTA消化后傳代。

1.2.2 細胞增殖抑制率測定 采用MTT比色法。取對數(shù)生長期細胞，消化后加培養(yǎng)液吹打均勻，以1×105/mL細胞密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μL細胞懸液，24 h后加入ATRA儲存液，并用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)終濃度為1×10－6mol/L。實驗組每組設6復孔，24 h更換培養(yǎng)液，分別將ATRA作用1、2、3、5 d后的細胞進行測定，向每孔培養(yǎng)液中加入5 mg/mL的MTT 20 μL，小心吸去上清，4 h后每孔加150 μL DMSO液終止反應，用酶標儀測490 nm波長的吸光度(A值)，計算細胞增殖抑制率。同時設空白對照孔。

1.2.3 細胞周期分布檢測 收集兩組懸浮細胞和貼壁細胞，細胞數(shù)不低于1×106個，離心后棄上清，用冷PBS漂洗，冷乙醇固定，在4℃冰箱中過夜。次日離心棄乙醇，用PBS漂洗后，上流式細胞儀進行細胞周期檢測。

1.2.4 SKOV3細胞中的NDRG1蛋白表達檢測采用免疫組化SP法。取兩組細胞爬片標本，嚴格按照試劑盒說明檢測兩組NDRG1蛋白表達。用冷丙酮固定，PBS沖洗，1%的Triton修復暴露抗原，10%山羊血清封閉非特異性結合位點;滴加適當稀釋的一抗，置37℃溫箱孵育2 h或4℃冰箱過夜，依次滴加二抗、三抗，行DAB顯色、蘇木精復染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。在倒置顯微鏡下觀察兩組細胞形態(tài)變化，NDRG1蛋白表達陽性著色呈棕黃色或黃色顆粒，位于細胞質(zhì)及細胞核周圍。每組隨機選取30個視野，用雙評分半定量法評分:①按陽性細胞百分率計分:陽性細胞百分率≤5%計0分，6% ～25%記1分，26% ～50%計2分，51% ～75%計3分，＞75%計4分。②按染色強度計分:無著色計0分，淡棕黃色或黃色計1分，棕黃色或黃色計2分。兩項合并得0分為陰性(－)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性(++)，5～6分為強陽性(+++)。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，計量資料用±s表示，組間比較用t檢驗;計數(shù)資料用百分比表示，組間比較用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ATRA作用不同時間點的A值比較 見表1。實驗組各時間點的A值均明顯低于對照組(P均＜0.05);實驗組 ATRA 作用后1、2、3、5 d，其細胞增殖抑制率分別為 16.7%、20.9%、23.1%、28.6%，兩兩比較P均＜0.05。

表1 兩組ATRA作用不同時間點的A值比較(±s)

表1 兩組ATRA作用不同時間點的A值比較(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

組別ATRA作用后A值1 d 2 d 3 d 5 d對照組0.30 ±0.08 0.48 ±0.05 0.52 ±0.02 0.63 ±0.09實驗組 0.25 ±0.03*0.38 ±0.06*0.40 ±0.09*0.45 ±0.04*

2.2 兩組細胞周期比較 對照組細胞周期為G1/G0期(50.1 ±0.9)%、S期(28.4 ±0.25)%;實驗組1、2、3、5 d 的 G1/G0期細胞分別為 (58.2 ±0.38)%、(62.9 ±0.32)%、(65.4 ±0.12)%、(68.9±0.41)%，S 期細胞分別為(25.1 ±0.49)%、(22.9±0.33)%、(21.0 ±0.51)%、(19.2 ±0.18)%。與對照組比較，實驗組G1/G0期細胞增多，S期細胞減少(P 均＜0.05)。

2.3 兩組NDRG1蛋白表達比較 見表2。

表2 兩組NDRG1蛋白表達比較

2.4 細胞形態(tài)變化 倒置顯微鏡下，對照組細胞大小均勻，貼壁生長。實驗組細胞生長緩慢，數(shù)量減少，細胞大小不一，形態(tài)不規(guī)則，貼壁能力減弱，細胞膜絨毛減少，細胞核光滑無切跡，分裂像少見，凋亡細胞較多。

3 討論

誘導分化是指惡性腫瘤細胞在體外分化誘導劑作用下，向正?；蚪咏＜毎较蚍只孓D(zhuǎn)的現(xiàn)象。維甲類化合物具有較好的誘導分化和增殖抑制作用，其主要通過誘導核維甲酸受體表達起作用，同時抑制異常角化，調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因表達［3，4］，其代表藥物是ATRA。研究表明，ATRA能誘導多種腫瘤細胞分化或抑制腫瘤細胞增殖。上世紀80年代王振義等［5］首先用ATRA治療急性早幼粒細胞白血病，取得較高的緩解率。本研究發(fā)現(xiàn)，ATRA可抑制SKOV3細胞生長，且隨時間延長其抑制作用明顯，提示ATRA有較強的抑制癌細胞增殖和誘導其分化作用。

有研究表明，細胞周期長短主要決定于G1期，G1期阻滯可使細胞周期延長，導致細胞增殖減慢，Inui等［6］研究表明ATRA可影響細胞DNA的合成，改變細胞周期和信號傳導途徑，使細胞在G1期前停滯。本研究顯示，ATRA作用于SKOV3細胞后，G1/G0期細胞增多，S期細胞減少，說明ATRA能阻止細胞由G1/G0期向S期轉(zhuǎn)化，延長細胞分裂周期，抑制細胞增殖，與駱霞崗等［7］在研究ATRA對人胰腺癌細胞PC-3誘導分化作用中的結論相同。本研究還發(fā)現(xiàn)，ATRA處理后的細胞在形態(tài)學上出現(xiàn)了良性分化表現(xiàn)，即細胞增殖受抑制，細胞數(shù)量減少，細胞貼壁能力減弱，細胞膜絨毛減少，細胞核分裂像少見，凋亡細胞較多，與張強等［8，9］觀察 ATRA 對人骨肉瘤細胞影響的結果相似。

NDRG1基因是新發(fā)現(xiàn)的與細胞分化有關的基因，廣泛存在于人體各組織中，在其生長過程中起重要作用。Kurdistani等［10］發(fā)現(xiàn)，NDRG1基因在乳腺癌、前列腺癌細胞株及腫瘤組織中呈低表達，其過表達可抑制腫瘤細胞生長。研究表明，NDRG1可被多種分化調(diào)節(jié)劑誘導表達，如缺氧及鎳化合物、維甲酸、維生素 D3等可使其 mRNA或蛋白表達上調(diào)［11，12］。1999 年 Piquemal等［13］曾報道用多種分化誘導劑處理白血病細胞株U937，發(fā)現(xiàn)NDRG1蛋白表達出現(xiàn)上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，ATRA作用于SKOV3細胞后，NDRG1蛋白表達高于對照組，提示ATRA有誘導NDRG1表達的作用，表明NDRG1參與了卵巢癌細胞的誘導分化，維甲酸可能通過調(diào)節(jié)其表達而促進細胞分化、抑制細胞增殖。

綜上所述，ATRA有抑制卵巢癌細胞增殖、誘導其分化的作用，將誘導分化治療作為卵巢癌的綜合治療方法具有現(xiàn)實意義。

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