秦 虹，歐 超，曹 驥，蘇建家，李 媛，楊 春

(1廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所實驗研究部，南寧530021;2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院)

細(xì)胞周期調(diào)控與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其異常對腫瘤形成有重要作用［1］。近年研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin B1異常表達與多系統(tǒng)常見腫瘤的分級分化、浸潤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)有關(guān)［2～5］，對腫瘤的惡性生物學(xué)行為及預(yù)后有重要意義。我們前期研究提示Cyclin B1基因可能是肝癌發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用的基因之一［6］。為探討Cyclin B1基因可能在肝癌組織中的表達及意義，2010～2013年，我們進行了相關(guān)研究?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar雄性大鼠70只，4周齡，體質(zhì)量40～60 g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。SYBR Premix Ex TaqTM購自TaKaRa，多克隆兔抗Cyclin B1(ab2949)購自Abcam公司，單克隆鼠抗GAPDH購自北京中杉金橋公司，Dylight 680熒光羊抗兔和羊抗鼠二抗購自LI-COR公司，Super PicTureTm Polymer通用型二抗購自Invitrogen公司。實時熒光定量PCR儀為ABI prismor 7900 HT，紅外熒光成像儀Odyssey購自LI-COR公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及標(biāo)本處理 按大鼠體質(zhì)量大小，隨機分為實驗組50只，腹腔注射黃曲霉毒素B1(AFB1);對照組20只，腹腔注射等量溶媒 DMSO［7，8］。實驗第 13、33、53 周進行大鼠肝活檢，第 73周處死兩組大鼠并取肝組織。第73周實驗結(jié)束時，實驗組經(jīng)病理組織學(xué)檢查確認(rèn)為肝癌15只，肝癌發(fā)生率為30%(15/50);對照組無腫瘤發(fā)生。選擇實驗組15只成癌大鼠與對照組10只大鼠第13、33、53、73周的肝組織標(biāo)本進行研究，兩組肝組織標(biāo)本部分用液氮速凍保存，部分用中性甲醛固定、常規(guī)脫水包埋。

1.2.2 肝組織Cyclin B1 mRNA表達檢測 采用QPCR技術(shù)檢測。用 Trizol試劑提取大鼠肝組織RNA，A260/A280值1.8 ～2.0 為合格，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所得總RNA的完整性。選取完整的mRNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA溶液。Cyclin B1的上、下游引物序列分別為:5'-TTGTGTGCCCAAGAAGATGCT-3'和5'-TCCATCTGTCTGATTTGGTGCTT-3'，GAPDH上、下游引物序列分別為:5'-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3'和5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3'。按熒光定量試劑盒說明書進行PCR擴增，反應(yīng)結(jié)束后獲取 Ct值，以2-ΔΔCt法計算目的基因Cyclin B1的相對表達水平，并根據(jù)溶解曲線判斷產(chǎn)物的純度。

1.2.3 肝組織 Cyclin B1蛋白表達檢測 采用Western blot法檢測。用常規(guī)方法提取大鼠肝組織總蛋白，用BCA試劑盒行蛋白測定，加入上樣緩沖液煮沸變性，以GADPH為內(nèi)參，行10%SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，一抗4℃培育過夜，熒光二抗常溫避光培育1 h，以紅外熒光成像儀掃描圖像，讀取灰度值。計算各只大鼠肝組織標(biāo)本中的Cyclin B1和GAPDH灰度值比值，作為Cyclin B1蛋白相對表達水平。

1.2.4 Cyclin B1蛋白免疫組化染色 常規(guī)脫蠟、水化，高壓修復(fù)，雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加Cyclin B1抗體于37℃孵育90 min，滴加二抗于37℃孵育30 min，DAB溶液顯色，蘇木素復(fù)染。每批染色均設(shè)已知陽性切片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。結(jié)果判定:Cyclin B1蛋白以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性顯色。陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為(-)，陽性細(xì)胞數(shù)5% ～25%為(+)，陽性細(xì)胞數(shù)26% ～50%為(++)，陽性細(xì)胞數(shù)＞50%為(+++)。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計量資料用±s表示，組間比較用t檢驗，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析;計數(shù)資料比較用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組不同時間點的肝組織Cyclin B1 mRNA表達水平比較 見表1。

2.2 兩組不同時間點的肝組織Cyclin B1蛋白表達水平比較 見表2。

表1 兩組不同時間點的肝組織Cyclin B1 mRNA表達水平比較(±s)

表1 兩組不同時間點的肝組織Cyclin B1 mRNA表達水平比較(±s)

注:與同組第13、33、53 周比較，*P ＜0.05;與對照組同期比較，ΔP ＜0.05

組別 n Cyclin B1 mRNA 表達第13周 第33周 第53周 第73周實驗組 15 1.320 ±0.399 1.539 ±0.789 1.481 ±0.660 3.948 ±0.958*Δ對照組 10 1.160 ±0.680 1.118 ±0.521 1.138 ±0.472 1.089 ±0.434

表2 兩組不同時間點的肝組織Cyclin B1蛋白表達水平比較(±s)

表2 兩組不同時間點的肝組織Cyclin B1蛋白表達水平比較(±s)

注:與同組第13、33 周比較，*P ＜0.05;與對照組同期比較，ΔP ＜0.05

組別 n Cyclin B1蛋白表達第13周 第33周 第53周 第73周實驗組 15 0.335±0.068 0.348 ±0.061 0.418 ±0.108*Δ 0.748±0.137*Δ對照組 10 0.321 ±0.050 0.338 ±0.075 0.327 ±0.098 0.355 ±0.098

2.3 兩組不同時間點的肝組織Cyclin B1蛋白免疫組化染色比較 實驗組肝組織Cyclin B1蛋白第13、33周(誘癌早期)均呈陰性表達;第53周(出癌前)的陽性率為26.7%(4/15)，其中(+)3 例、(++)1 例;第73周(成癌期)陽性率為66.7%(10/15)，其中(+)、(++)各2例，(+++)6例。對照組各時間點的肝組織Cyclin B1蛋白均呈陰性表達。實驗組第53、73周的Cyclin B1蛋白陽性率明顯高于對照組，且第53、73周陽性率比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P均＜0.05)。

3 討論

Cyclin B1作為細(xì)胞周期家族成員，是控制細(xì)胞進入G2/M檢測點的關(guān)鍵因子［9，10］，其在 G1期表達很低，S期和G2期逐漸升高，G2/M期轉(zhuǎn)變時達到高峰［11，12］。激活的 Cyclin B1/p34cdc2復(fù)合物(即成熟促進因子)在M期發(fā)揮激酶作用，使一系列的特異性底物發(fā)生磷酸化，從而促進有絲分裂進行［13］。王東等［14］應(yīng)用免疫組化法檢測Cyclin B1蛋白在大鼠誘發(fā)肝癌過程中的表達，發(fā)現(xiàn)在實驗大鼠肝細(xì)胞增生—硬化期和肝細(xì)胞癌變期，其肝組織Cyclin B1蛋白表達均高于正常對照組。本研究發(fā)現(xiàn)，肝組織Cyclin B1 mRNA表達早期不明顯，第73周時的表達水平明顯高于第13、33、53周;但Cyclin B1蛋白在誘癌早期表達變化不大，但至第53周時其表達水平呈增高趨勢，在成癌的第73周表達水平最高;提示Cyclin B1蛋白表達異?？赡苁歉伟┌l(fā)生前的早期事件，可作為診斷早期肝癌的參考標(biāo)志物之一。為驗證Cyclin B1蛋白在肝組織中的表達情況，本研究采用免疫組化技術(shù)檢測了大鼠肝組織中的Cyclin B1蛋白表達，結(jié)果顯示其表達變化與Western blot法檢測結(jié)果一致，本研究結(jié)果與文獻報道結(jié)果相似［13］。提示從 AFB1誘癌開始到肝癌形成期間，Cyclin B1基因是一個不斷積累和過表達的過程，直至肝癌發(fā)生。

綜上所述，Cyclin B1基因與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其在誘發(fā)性大鼠肝癌模型中表達敏感，在肝癌早期表達逐步升高，且在肝癌組織中明顯高表達，其表達強度逐步增強。本研究提示Cyclin B1過表達不但可作為肝癌早期診斷的參考標(biāo)志物之一，而且可作為評價肝癌及其預(yù)后的標(biāo)志之一，也為肝癌的基因治療及治療新靶點提供實驗依據(jù)。

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