張巧鳳，郭鈺琪，李 霞，王 麗，張洪海，姚成芳

(1山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，濟(jì)南250062;2濟(jì)南大學(xué)、山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院)

機(jī)體的免疫功能受外界環(huán)境因素的影響，溫度變化也可影響免疫功能［1，2］。低溫可致人體免疫功能下降，對慢性支氣管炎、哮喘等疾病易感或加重［3］。機(jī)體的皮膚及黏膜系統(tǒng)作為與外界相通的屏障，對環(huán)境溫度變化極敏感。樹突狀細(xì)胞(DC)是機(jī)體黏膜系統(tǒng)的重要組成部分，是連接固有免疫及適應(yīng)性免疫的橋梁，在組織局部捕獲抗原后，通過循環(huán)系統(tǒng)遷移，并依賴其表面分子遞呈抗原、啟動T細(xì)胞活化及極化，發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。目前關(guān)于低溫對DC的影響尚不明了。中藥玉屏風(fēng)散為防邪入侵的經(jīng)典方劑，具有抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及增強(qiáng)免疫功能等作用［4］，臨床廣泛用于治療外感疾病。為探討低溫及玉屏風(fēng)散處理對DC功能的影響，2012年10月～2013年9月，我們進(jìn)行了相關(guān)研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實(shí)驗(yàn)動物:清潔級雌性BALB/c小鼠50只，6～8 周齡，體質(zhì)量(17.92 ±1.03)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物公司。②藥物、試劑及儀器:玉屏風(fēng)散由防風(fēng)、黃芪、白術(shù)組成。FITC-CD86、PE-I-Ad(MHC-Ⅱ，BD Pharmingen 公司)，PE-Cy5-CD11C(eBioscience公司)，CFS-CCR7(R ＆ D 公司)，dNTP、RNA酶抑制劑、Taq酶(上海生工生物公司)，內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、CD86、CCR7引物由上海鉑尚生物公司合成。流式細(xì)胞儀(美國BECKMAN)，紫外分光光度計(jì)、凝膠成像系統(tǒng)(美國)，PCR擴(kuò)增儀(德國Biometra)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將50只小鼠隨機(jī)均分為對照組(室溫25℃)、模型組(室溫10℃)及玉屏風(fēng)散小、中、大劑量組。玉屏風(fēng)散小、中、大劑量組分別為225、450、900 mg/(kg·d)，連用 7 d;對照組及模型組自由飲水。給藥第4天時(shí)，將模型組及玉屏風(fēng)散各組置于低溫［(10±1)℃］容器內(nèi)，連續(xù)處理3 d，每天6 h。

1.2.2 DC表面分子表達(dá)檢測 各組小鼠眼球取血約1 mL，置于抗凝管中，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞，PBS洗兩遍，收集細(xì)胞。用PBS將收集的外周血單個核細(xì)胞重懸至100 μL，每管加入新鮮大鼠血清 20 μL，室溫、避光孵育30 min。按流式抗體說明書依次加入以下抗體，即PEI-Ad、PE-Cy5-CD11C、FITC-CD86或 PE-I-Ad、PE-Cy5-CD11C、CFS-CCR7，4 ℃避光染色 30 min，用 PBS 清洗兩遍，用流式細(xì)胞術(shù)檢測DC表面分子MHC-Ⅱ、CCR7、CD86表達(dá)。

1.2.3 CCR7、CD86mRNA表達(dá)檢測 外周血單個核細(xì)胞總RNA提取:將分離的外周血單個核細(xì)胞先后用TRIzon試劑裂解、氯仿抽提、異丙醇沉淀、75%乙醇及無水乙醇洗滌，經(jīng)紫外分光光度儀檢測RNA的純度與含量。RT反應(yīng):采用Oligo dT為RT反應(yīng)引物，取1.5 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 40 μL。PCR反應(yīng):總反應(yīng)體系為25 μL，包含RT 產(chǎn)物4.5 μL、10 ×PCR buffer 2.5 μL、25 mmol/L MgCl22 μL、上下游引物各0.25 μL、10 mmol/L dNTP 0.5 μL、Taq DNA 聚合酶 1 μL，DEPC水14 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，94℃ 1 min，58～60℃ 1 min，72℃ 1 min，26個循環(huán)后，70℃補(bǔ)延伸10 min。用1.5%凝膠電泳后，采用Alpha凝膠成像系統(tǒng)分析目的基因的表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算目的基因片段CD86、CCR7與同步GAPDH的灰度值比，作為其mRNA相對表達(dá)量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，計(jì)量資料兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較用One Way-ANOVA方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組體質(zhì)量及肛溫比較 連續(xù)低溫處理3 d后，對照組體質(zhì)量及肛溫分別為(17.68±1.57)g、(35.96 ±1.61)℃，模型組分別為(18.66 ±0.90)g、(33.40 ±1.26)℃，玉屏風(fēng)散小劑量組分別為(17.16 ±0.95)g、(34.30 ±1.49)℃，玉屏風(fēng)散中劑量組分別為(17.14 ±0.82)g、(34.16 ±2.31)℃，玉屏風(fēng)散大劑量組分別為(18.00 ±1.63)g、(34.32 ±1.08)℃。各組體質(zhì)量比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;與對照組比較，其余4組肛溫降低(P均＜0.05)。

2.2 各組 MHC-Ⅱ、CCR7、CD86蛋白表達(dá)比較 見表1。

表1 各組 MHC-Ⅱ、CCR7、CD86蛋白表達(dá)比較(n=10，%，±s)

表1 各組 MHC-Ⅱ、CCR7、CD86蛋白表達(dá)比較(n=10，%，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05;與玉屏風(fēng)散其他劑量組比較，▲P ＜0.05

35.93 ±2.99 16.87 ±0.59 28.65 ±4.22模型組 26.25 ±3.85* 12.40 ±1.16＊＊ 16.31 ±0.67＊＊玉屏風(fēng)散小劑量組 32.15 ±5.04▲ 12.13 ±1.93 21.77 ±1.43△玉屏風(fēng)散中劑量組 42.84 ±4.47△ 21.84 ±3.99△▲ 25.76 ±4.05△玉屏風(fēng)散大劑量組 44.04 ±4.67△ 14.04 ±3.46 28.47 ±2.61對照組△

2.3 各組CCR7、CD86mRNA相對表達(dá)量比較 對照組CCR7、CD86mRNA相對表達(dá)量分別為0.44±0.13、0.38 ±0.08，模型組分別為 0.32 ±0.03、0.21±0.04，玉屏風(fēng)散小劑量組分別為 0.31 ± 0.05、0.41±0.05，玉屏風(fēng)散中劑量組分別為 0.50 ±0.12、0.25 ±0.06，玉屏風(fēng)散大劑量組分別為0.61 ±0.08、0.36 ±0.06。模型組與對照組，模型組與玉屏風(fēng)散中、大劑量組比較，CCR7、CD86mRNA相對表達(dá)量下降(P均 ＜0.05)。

3 討論

機(jī)體體表皮膚溫度較其他部位略低，易受外界環(huán)境溫度的影響［5］。作為皮膚和黏膜系統(tǒng)的重要固有免疫細(xì)胞，DC在局部組織中發(fā)揮重要的免疫屏障作用，在穩(wěn)態(tài)條件下DC介導(dǎo)機(jī)體維持耐受，機(jī)體受病原體侵襲時(shí)引起免疫反應(yīng)［6，7］。

DC分為非成熟階段及成熟階段，穩(wěn)態(tài)條件下，體內(nèi)多數(shù)DC處于未成熟狀態(tài)，具有較強(qiáng)的吞噬、攝取抗原能力;未成熟DC通過其表面的模式識別受體(如Toll樣受體)接觸抗原或受炎癥因子影響后，開始從局部組織向外周淋巴器官遷移［8］。在遷移過程中DC逐漸成熟，其可上調(diào)共刺激分子CD80、CD86表達(dá)，以及高表達(dá) MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子等，將加工、處理后的抗原以抗原肽-MHC-Ⅱ類分子復(fù)合物的形式遞呈給初始T細(xì)胞使之激活，從而啟動適應(yīng)性的免疫應(yīng)答［9］。在遷移過程中，DC主要通過淋巴管或血循環(huán)進(jìn)入次級淋巴器官，外周血是各組織DC捕獲抗原后發(fā)生遷移的匯聚地。

以往文獻(xiàn)報(bào)道，溫度降低時(shí)機(jī)體免疫功能受到抑制，對病原體感染的抵抗力降低［10～12］，但對其免疫機(jī)制尚不清楚。本研究顯示，低溫下循環(huán)DC表達(dá)CCR7的能力降低，顯示DC遷移能力下降;DC表面分子MHC-Ⅱ、CD86表達(dá)下調(diào)，提示抗原遞呈并刺激初始T細(xì)胞活化的能力降低。鑒于DC在固有免疫及適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用，一直以來其都被認(rèn)為是免疫治療的最佳選擇［13］。因此，以后研發(fā)DC相關(guān)疫苗及其用于其他免疫治療時(shí)，均應(yīng)考慮低溫對DC生物學(xué)功能的影響。

玉屏風(fēng)散出自元代朱震亨的《丹溪心法》，由黃芪、防風(fēng)、白術(shù)配伍組成，是益氣、固表、防邪入侵的經(jīng)典方劑，臨床多用于治療變態(tài)反應(yīng)性疾?。?4］。該方劑具有抗病毒、抗細(xì)菌感染功效［15］，可促進(jìn)小鼠呼吸道、腸道黏膜分泌 SIgA，增強(qiáng)局部免疫功能［16～17］，促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［18］。本研究顯示，與模型組相比，玉屏散各組 DC表面分子MHC-Ⅱ、CCR7、CD86表達(dá)水平提高，抗原遞呈能力增強(qiáng)。提示玉屏風(fēng)散可提高上述分子的表達(dá)水平，逆轉(zhuǎn)低溫引起的DC功能下降，有利于DC在局部黏膜免疫中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，低溫條件下DC表面分子表達(dá)降低，玉屏風(fēng)散能增強(qiáng)小鼠的DC功能，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，這可能是其發(fā)揮益氣固表、防邪入侵的藥理基礎(chǔ)。

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