汪建明，陶 杰，賈 磊

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

傳統(tǒng)開菲爾是以牛奶、羊奶為原料，由開菲爾?；蜷_菲爾粒中必需菌作發(fā)酵劑，發(fā)酵制得的一種富含蛋白質(zhì)、維生素、酸、乙醇等及少量 CO2的營養(yǎng)型發(fā)酵乳[1]．其中的物質(zhì)主要包括開菲爾多糖、乳酸、醋酸、脂肪酸、氨基酸、維生素、風(fēng)味化合物等[2-4]．由于開菲爾營養(yǎng)豐富且對人體有保健功效，因此早已成為研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)．但是，目前國內(nèi)外對于開菲爾的研究主要集中在開菲爾粒的微生物組成和傳統(tǒng)開菲爾的工藝優(yōu)化上，如國外 Witthuhn等[5]、Poga?i?等[6]、Simova等[7]對于開菲爾粒及其中幾種重要菌種的研究，以及國內(nèi)劉慧等[8]、張慧敏等[9]對于開菲爾功能特性的研究．這些研究都是從開菲爾的發(fā)酵菌種角度出發(fā)．

本文從開菲爾的發(fā)酵原料出發(fā)，利用部分豆乳代替牛乳，根據(jù)開菲爾的特點(diǎn)，主要考察了牛乳與豆乳的添加比例、蔗糖添加量、發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵制品的影響，以獲得混合乳發(fā)酵制備仿開菲爾的最佳工藝參數(shù)，從而開發(fā)符合中國消費(fèi)者觀念的仿開菲爾產(chǎn)品．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料

大豆，市售；白砂糖，上海上棠食品有限公司；脫脂乳粉，新西蘭紐瑞滋有限公司；開菲爾酸奶，北京川秀國際貿(mào)易有限公司．

1.1.2 菌種

釀酒酵母(Saccharomyces cereviviscence)Y1，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院；保加利亞乳桿菌(Lactobacillus ssp.bulgaricus)B1、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)T5，DSM 中國有限公司．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 理化指標(biāo)的測定

pH采用pH計(jì)測定；酸度采用滴定法[10]測定；黏度采用 DV-III＋型流變儀(Brookfield公司)測定；乙醇的含量采用氣相色譜法測定．

1.2.2 感官評價(jià)方法

感官評價(jià)方法見表1．

表1 感官評分表Tab.1 Sensory evaluation of products

1.2.3 豆乳的制備及牛乳的配制

豆乳制備的工藝流程為：大豆清洗→干燥去皮→浸泡(豆水比例為 1∶3，浸泡 12,h)→磨漿→分離→滅菌→滅酶→冷卻．牛乳配制中乳粉與水的比例為1∶8．

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過前期單因素實(shí)驗(yàn)確定混合乳制備仿開菲爾的酵母菌和乳酸菌的接種量分別是 1.0×105,mL–1和1.0×107,mL–1，最佳的發(fā)酵溫度是22,℃．在本實(shí)驗(yàn)中固定以上條件．

(1)牛乳與豆乳比例對發(fā)酵的影響：分別配制牛乳與豆乳比例為 10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、3∶7、0∶10的混合乳，加入 1.0%的蔗糖，以接種量為 1.0×105,mL–1和 1.0×107,mL–1分別接入酵母菌和乳酸菌，22,℃發(fā)酵 20,h，10,℃成熟 12,h后取樣測定各發(fā)酵乳的 pH、酸度、乙醇含量，同時(shí)進(jìn)行感官評定．

(2)蔗糖添加量對發(fā)酵的影響：在最佳牛乳與豆乳比例的混合乳中，分別加入 0.0%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%的蔗糖，以接種量為1.0×105,mL–1和1.0×107,mL–1分別接入酵母菌和乳酸菌，22,℃發(fā)酵20,h，10,℃成熟 12,h后取樣測定各發(fā)酵乳的 pH、酸度、乙醇含量，同時(shí)進(jìn)行感官評定．

(3)發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵的影響：在最佳牛乳與豆乳比例的混合乳中加入最佳添加量的蔗糖，以接種量為1.0×105,mL–1和 1.0×107,mL–1分別接入酵母菌和乳酸菌，22,℃分別發(fā)酵 12、16、18、20、22,h，10,℃成熟12,h后取樣測定各發(fā)酵乳的 pH、酸度、乙醇含量，同時(shí)進(jìn)行感官評定．

2 結(jié)果與討論

2.1 牛乳與豆乳比例對仿開菲爾發(fā)酵的影響

牛乳與豆乳比例對仿開菲爾發(fā)酵的影響如圖 1和圖2所示．

圖1 牛乳與豆乳比例對pH和酸度的影響Fig.1 Effect of the ratio of cow milk to soybean milk on pH and acidity

由圖 1可知：隨著豆乳比例的增加，酸度呈下降趨勢，發(fā)酵純豆乳的酸度僅為 0.32%，顯著低于發(fā)酵純牛乳(P＜0.05)．這主要是由于豆乳組成與牛乳不同，缺少乳糖，乳酸菌生長不良，產(chǎn)酸少，酸度不夠[10].

圖2 牛乳與豆乳比例對乙醇含量和感官品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of the ratio of cow milk to soybean milk on ethanol content and sensory properties

由圖 2可見：當(dāng)牛乳與豆乳比例為 7∶3時(shí)，發(fā)酵乳細(xì)膩，既具有豆奶清香味又不失酸奶的香味，醇香和氣泡都適宜，感官品質(zhì)較好，且隨著牛乳比例的增加，感官評分無顯著差異(P＞0.05)．這與肖琳琳等[11]用開菲爾粒生產(chǎn)大豆酸凝乳得到的結(jié)論相同，豆?jié){比例增加后，出現(xiàn)澀口感．綜合考慮諸因素，確定牛乳與豆乳的較佳比例為7∶3．

2.2 蔗糖添加量對仿開菲爾發(fā)酵的影響

考察蔗糖添加量對仿開菲爾發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖3和圖4所示．

圖3 蔗糖添加量對pH和酸度的影響Fig.3 Effect of the amount of sucrose on pH and acidity

圖4 蔗糖添加量對乙醇含量和感官品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of the amount of sucrose on ethanol content and sensory properties

由圖3和圖4可以看出：酸度隨著蔗糖添加量的增大先上升后下降，當(dāng)蔗糖添加量為 3.0%時(shí)達(dá)到最大；乙醇含量隨著蔗糖添加量的增大而逐漸升高，當(dāng)添加量為 1.0%時(shí)，發(fā)酵乳乙醇含量達(dá) 1.338,mg/g，此后無明顯變化；在添加量為 1.0%時(shí)感官品質(zhì)最好，隨后呈下降趨勢，因此確定蔗糖的較佳添加量為1.0%．

2.3 發(fā)酵時(shí)間對仿開菲爾發(fā)酵的影響

不同發(fā)酵時(shí)間對仿開菲爾發(fā)酵的影響如圖 5和圖6所示．

圖5 發(fā)酵時(shí)間對pH和酸度的影響Fig.5 Effect of fermentation time on pH and acidity

圖6 發(fā)酵時(shí)間對乙醇含量和感官品質(zhì)的影響Fig.6 Effect of fermentation time on ethanol content and sensory properties

由圖 5和圖 6可以看出：當(dāng)發(fā)酵溫度為 22,℃時(shí)，酸度和乙醇含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而逐漸增加，發(fā)酵 22,h時(shí)達(dá)最高值，酸度和乙醇含量分別為0.78%和 1.837,mg/g；而感官評分呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，16,h時(shí)發(fā)酵乳感官品質(zhì)較好．劉慧等[12]研究開菲爾酸奶最佳發(fā)酵條件時(shí)同樣發(fā)現(xiàn)，若發(fā)酵時(shí)間過長，會導(dǎo)致產(chǎn)品酸度過高，產(chǎn)生刺激性酸味；若發(fā)酵時(shí)間過短，發(fā)酵不充分，酸度、酒精度較低，且保加利亞乳桿菌產(chǎn)酸較慢；但發(fā)酵時(shí)間過長，酸度過高，且酵母產(chǎn)生的 CO2過多，適量 CO2的存在可以給產(chǎn)品帶來特有的殺口感，但是過量的 CO2與乙醇等混合就會產(chǎn)生苦澀味．因此，最終將混合乳發(fā)酵時(shí)間確定為16,h．

2.4 開菲爾發(fā)酵的主要影響因素的確立

本研究首先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，確定了發(fā)酵條件(牛乳與豆乳比例為 7∶3，酵母菌接種量為1.0×105,mL–1，乳酸菌接種量為 1.0×107,mL–1，蔗糖添加量為1.0%，發(fā)酵溫度為22,℃，發(fā)酵時(shí)間為16,h)的大致變化范圍，然后進(jìn)行適當(dāng)?shù)臄U(kuò)充而成為自變量的取值范圍．各因素的水平和編碼見表2．

表2 26-2部分析因設(shè)計(jì)因素水平表Tab.2 Factor levels of 26-2 fractional factorial design

26-2部分析因設(shè)計(jì)需要 16次實(shí)驗(yàn)，為估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差和檢測彎曲效應(yīng)，在因子中心點(diǎn)處增加 6次重復(fù)，共需22次實(shí)驗(yàn)，其設(shè)計(jì)和結(jié)果見表3．

表3 26-2部分析因設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Tab.3 Experimental results and 26-2 fractional factorial design

根據(jù)表 3的數(shù)據(jù)，利用 Design-Expert 7.0軟件對部分析因?qū)嶒?yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到回歸模型方差分析見表4．

表4 回歸模型方差分析Tab.4 Analysis of variances of the regression model

由表 4可知：本實(shí)驗(yàn)所得的擬合回歸方程達(dá)到顯著水平(模型的 P＜0.000,1)．該模型的決定系數(shù)R2＝0.849,4，說明近 85%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)變異性可用此模型解釋，表明回歸模型與實(shí)際的擬合度比較好．彎曲的P值為0.093,7，表示響應(yīng)面沒有顯著的彎曲，說明探索范圍未接近最大響應(yīng)面區(qū)域．模型回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見表5．

表5 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Tab.5 Significance test of the regression coefficients

由表 5可知，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的水平范圍內(nèi)，X4(蔗糖添加量)和 X6(發(fā)酵時(shí)間)對開菲爾品質(zhì)均有顯著影響(P＜0.05)，且均達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)，二者的系數(shù)均為正，說明增加蔗糖含量和延長發(fā)酵時(shí)間對開菲爾品質(zhì)有積極的影響．而 X1(牛乳與豆乳比例)、X2(酵母菌接種量)、X3(乳酸菌接種量)、X5(發(fā)酵溫度)均無顯著影響(P＞0.05)，可在后續(xù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)中固定為中心點(diǎn)水平．因此，影響仿開菲爾發(fā)酵的主要影響因子為蔗糖添加量和發(fā)酵時(shí)間．回歸得到的多元一次方程為 Y＝84.31＋1.13,X4＋2.84,X6．式中：Y為感官評分的預(yù)測值；X4＝(蔗糖添加量－1.0)/0.5；X6＝(發(fā)酵時(shí)間－16)/2．

2.5 最陡爬坡路徑的確立

為了確定響應(yīng)變量 Y值所接近的最大響應(yīng)值區(qū)域，即取得最佳感官評分時(shí)的蔗糖添加量和發(fā)酵時(shí)間的取值范圍，設(shè)計(jì)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，最陡爬坡設(shè)計(jì)和結(jié)果見表 6．感官評分在點(diǎn)(β4＝1.6，β6＝22)，即在原點(diǎn)+3,Δ 時(shí)達(dá)到最大值．故以點(diǎn)(β4＝1.6，β6＝22)作為下步實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)．

表6 最陡爬坡法實(shí)驗(yàn)Tab.6 Steepest ascent experiment

2.6 發(fā)酵條件的優(yōu)化

采用 Design-Expert 7.0軟件生成的中心復(fù)合設(shè)計(jì)，取 4個(gè)星點(diǎn)(α＝±1.414)和 5次中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)．實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表 7，方差分析和模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見表8．

表7 中心復(fù)合設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Central composite design and results

表8 二階回歸模型方差分析Tab.8 Analysis of variances of the second-order regression model

對表 7中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析可得到二階擬合模型：Y＝92.84＋0.35,X4＋0.15,X6＋0.90,X4,X6－2.70－2.53．根據(jù)回歸分析結(jié)果繪響應(yīng)面圖，如圖 7所示．由于該方程的二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)數(shù)，所以方程代表的拋物面的開口向下，因而有極大值點(diǎn)．

圖7 響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface plot

由圖7可以看出，在蔗糖添加量(X4)為高水平或低水平時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，仿開菲爾的感官評分提高，但當(dāng)發(fā)酵時(shí)間(X6)過長時(shí)，對于仿開菲爾的品質(zhì)又有不利影響，這與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合．

進(jìn)一步用 Design-Expert 7.0軟件對實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行典型性分析，以獲得最優(yōu)的發(fā)酵條件．經(jīng)分析得，在 X4＝0.07、X6＝0.04，即在蔗糖添加量為 1.61%、發(fā)酵時(shí)間為22.09,h時(shí)得到仿開菲爾的品質(zhì)最好，感官評分為92.9．產(chǎn)品色澤鮮亮，呈略帶微黃的乳白色；口感柔和細(xì)膩，無澀口感；仿開菲爾均勻不分層，無雜質(zhì)且具有協(xié)調(diào)的酸豆奶發(fā)酵味及酵母發(fā)酵醇香氣.

為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性，采用得到的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際操作和生產(chǎn)的便利性，將發(fā)酵條件修正為蔗糖添加量為 1.6%、發(fā)酵時(shí)間為 22,h．3次平行實(shí)驗(yàn)得到的實(shí)際感官評分為 92.2，所得實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值接近，二者的良好擬合性證實(shí)了模型的有效性．在最佳優(yōu)化條件下，對仿開菲爾發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行理化指標(biāo)的測定，并與市售開菲爾進(jìn)行對比，結(jié)果見表9．

表9 理化指標(biāo)比較Tab.9 Comparison of chemical properties

由表 9可知：市售牛乳開菲爾的 pH、酸度分別為 4.15、0.92%；而本研究所得產(chǎn)品的 pH、酸度分別為 4.32、0.78%，與市售牛乳開菲爾存在顯著差異(P＜0.05)．這主要是由于豆乳中能被乳酸菌發(fā)酵的糖類較少，故產(chǎn)酸相對較少．本研究所得產(chǎn)品的乙醇含量較高，達(dá) 1.398,mg/g，而市售開菲爾的黏度略高(3.009,Pa·s)，但與本實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品差異并不顯著(P＞0.05). 通過感官分析結(jié)果可知，本研究所得產(chǎn)品與市售牛乳開菲爾相比，口感更加柔和細(xì)膩、酸甜更加適宜、香氣協(xié)調(diào)，改善了牛乳開菲爾的風(fēng)味．

因此，優(yōu)化后的仿開菲爾發(fā)酵條件為：牛乳與豆乳比例 7∶3，蔗糖添加量 1.6%，發(fā)酵溫度 22,℃，發(fā)酵時(shí)間22,h．

3 結(jié) 論

采用單因素和響應(yīng)面相結(jié)合的方式，在前期單因素實(shí)驗(yàn)確定混合乳制備仿開菲爾的酵母菌和乳酸菌的接種量分別為 1.0×105,mL–1和 1.0×107,mL–1，最佳的發(fā)酵溫度為 22,℃的條件下，通過單因素實(shí)驗(yàn)和中心復(fù)合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化混合乳發(fā)酵制備仿開菲爾的最佳工藝條件：牛乳與豆乳的添加比例為 7∶3，蔗糖添加量為 1.6%，發(fā)酵時(shí)間為 22,h．經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，此優(yōu)化得到的條件是混合乳發(fā)酵制備仿開菲爾的最優(yōu)條件．在此條件下仿開菲爾發(fā)酵產(chǎn)品的 pH為4.32，酸度為 0.73%，乙醇含量為 1.398,mg/g，黏度為2.990,Pa·s．進(jìn)行感官評價(jià)，該產(chǎn)品色澤鮮亮，呈略帶微黃的乳白色；口感柔和細(xì)膩，無澀口感；仿開菲爾均勻不分層，無雜質(zhì)且具有協(xié)調(diào)的酸豆奶發(fā)酵味及酵母發(fā)酵醇香氣．與市售開菲爾產(chǎn)品感官對比，所得產(chǎn)品質(zhì)地細(xì)膩、酸度適宜、香氣協(xié)調(diào)，改善了傳統(tǒng)開菲爾的風(fēng)味，更適宜我國消費(fèi)者．

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