陳 銳，朱 珠，蘭青闊，陳 佳，王 永

(1. 天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，天津 300381；2. 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；3. 天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)在提高農(nóng)作物產(chǎn)量、改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)、減少農(nóng)藥使用等方面正深刻地改變著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)格局．據(jù)統(tǒng)計(jì)[1]，2012年轉(zhuǎn)基因作物種植面積已達(dá)1.7×106平方千米，超過全球耕地面積的10%．轉(zhuǎn)基因試紙條檢測法是以抗原與抗體互相作用的免疫學(xué)理論為基礎(chǔ)的一種針對蛋白的檢測方法．該方法樣品前處理簡單、操作快捷，不需要特殊儀器設(shè)備，對操作人員也無過高技術(shù)要求，十分適用于田間快速檢測和產(chǎn)品成分篩查，在轉(zhuǎn)基因檢測市場具有廣闊的應(yīng)用前景．

Bt基因是目前抗蟲轉(zhuǎn)基因植物中使用最廣泛的外源基因，其來源于蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)，表達(dá)產(chǎn)物對多種農(nóng)業(yè)害蟲具有特異性毒殺作用[2]．在轉(zhuǎn)基因植物中，Bt蛋白表達(dá)占總可溶性蛋白的比例較高[3]，十分適用于試紙條方法檢測．

本研究以轉(zhuǎn)基因水稻 TT51-1中的外源 Bt基因?yàn)檠芯繉ο?，通過基因克隆、載體構(gòu)建、原核表達(dá)與純化等步驟，開展轉(zhuǎn)基因檢測用 Bt蛋白富集制備工作，為進(jìn)一步研發(fā)試紙條檢測產(chǎn)品提供物質(zhì)基礎(chǔ)與技術(shù)支持．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1由秦皇島出入境檢驗(yàn)檢疫局提供．

1.2 主要試劑

高保真 DNA聚合酶、瓊脂糖切膠回收試劑盒、HindⅢ與 BamHⅠ內(nèi)切酶，寶生物工程(大連)有限公司；pGEM-T easy載體、T4,DNA 連接酶，Promega公司；質(zhì)粒提取試劑盒、JM109感受態(tài)細(xì)胞，北京博邁德生物技術(shù)有限公司；pET-28a質(zhì)粒與大腸桿菌(E.coli)BL21菌株由天津大學(xué)黃金海教授饋贈．

1.3 基因組DNA提取

DNA提取參照農(nóng)業(yè)部1485號公告–4–2010《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測DNA提取和純化》[4]進(jìn)行；使用1%瓊脂糖凝膠電泳與Nanodrop ND1000核酸蛋白測定儀評估質(zhì)量并定量．

1.4 引物設(shè)計(jì)

依據(jù) GenBank EU880444.1序列信息，在 Bt基因兩端設(shè)計(jì)引物并在上下游引物的 5’端分別加入BamHⅠ和 HindⅢ酶切位點(diǎn)與保護(hù)堿基．表達(dá)載體構(gòu)建驗(yàn)證引物分別設(shè)計(jì)在 BamHⅠ與 HindⅢ酶切位點(diǎn)兩側(cè)．全部引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列詳見表1．

表1 本研究使用引物Tab.1 Primers used in this study

1.5 Bt基因克隆

PCR 反應(yīng)體系(50,μL)為：100,ng/μL 模板 DNA 1,μL，10×PCR Buffer 5,μL，10,mmol/L dNTPs 1,μL，10,mmol/L 上下游引物各 1,μL，5,U/μL Taq 酶 1,μL，滅菌去離子水 40,μL．?dāng)U增程序?yàn)椋?5,℃預(yù)變性5,min；95,℃變性 45,s，56,℃退火 45,s，72,℃延伸2,min，共計(jì) 35個循環(huán)；72,℃延伸 10,min．PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收1.8,kbp目的條帶，連接pGEM-T載體后轉(zhuǎn)化JM109，挑取白色菌落搖菌培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，PCR驗(yàn)證的陽性克隆(T-cry)培養(yǎng)物送至金維智生物科技(蘇州)有限公司完成測序．

1.6 原核表達(dá)載體構(gòu)建

使用限制性內(nèi)切酶 HindⅢ與 BamHⅠ分別對 T-cry與pET-28a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，連接載體與目的片段后熱激轉(zhuǎn)化JM109，篩選 Kan+抗性重組轉(zhuǎn)化體進(jìn)行 PCR及雙酶切鑒定．

1.7 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-cry轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)，挑取Kan+抗性菌落搖菌活化，取培養(yǎng)物按 1∶100加入 Kan+抗性 2×YT液體培養(yǎng)基，加入終濃度0.1,mmol/L的IPTG，25,℃、120,r/min誘導(dǎo)培養(yǎng) 6,h，誘導(dǎo)菌液經(jīng)超聲裂解提取蛋白，12% SDSPAGE檢驗(yàn)表達(dá)情況．取陽性菌株 37,℃條件下進(jìn)行大量培養(yǎng)，超聲波破菌后離心收集包涵體，TritoxX-100洗滌，8,mol/L尿素溶解．蛋白純化使用 SDSPAGE切膠分離與透析袋水平電泳法回收純化目的蛋白[5]．紫外分光光度法測定蛋白的 A260、A280，按照經(jīng)驗(yàn)公式(1)計(jì)算蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/mL)．

蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度＝1.45×A280–0.74×A260(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt基因克隆

轉(zhuǎn)基因水稻 TT51-1基因組 DNA提取后 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，DNA條帶清晰、質(zhì)量完好、無降解彌散與RNA污染(圖1a)．Bt基因擴(kuò)增得到片段大小約為 1.8,kbp，與預(yù)期產(chǎn)物長度相符(圖1b)．TA 克隆轉(zhuǎn)化 JM109后，Amp+平板挑取白斑搖菌活化，質(zhì)粒 PCR檢測結(jié)果顯示，多數(shù)轉(zhuǎn)化子攜帶1.8,kbp目的條帶(圖1c)．測序驗(yàn)證Bt基因序列及兩端酶切位點(diǎn)，選取序列完全正確的克隆用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖 1d)．

圖1 Bt基因克隆結(jié)果Fig.1 Results of Bt gene cloning

2.2 原核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

T-cry質(zhì)粒經(jīng) HindⅢ與 BamHⅠ內(nèi)切酶消化后，產(chǎn)生 1.8,kbp目的條帶與 3,kbp載體線性化條帶(圖2a)．pET-28a質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ與BamHⅠ內(nèi)切酶消化，產(chǎn)生 5.3,kbp載體線性化條帶(圖 2b)．切膠回收1.8,kbp目的條帶與線性化pET-28a，連接轉(zhuǎn)化JM109后，Kan+平板挑取克隆搖菌活化并提取質(zhì)粒．載體構(gòu)建驗(yàn)證引物分別位于上下游連接位點(diǎn)兩側(cè)，PCR鑒定分別獲得預(yù)期 491,bp與 273,bp大小條帶(圖2c)．進(jìn)一步Hind/ⅢBamHⅠ雙酶切檢測結(jié)果證明，成功構(gòu)建原核表達(dá)載體 pET-28a-cry，Bt基因插入位置與方向正確無誤(圖2d)．

圖2 ,pET-28a-cry原核表達(dá)載體構(gòu)建Fig.2 Construction of prokaryotic expression vector pET-28a-cry

2.3 目的基因原核表達(dá)與純化

將pET-28a-cry轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，Kan+平板挑取克隆搖菌活化，0.1,mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)后 SDSPAGE檢測結(jié)果顯示，成功表達(dá)預(yù)期蛋白，條帶大小與理論值相符，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在(圖3a)．重組蛋白包括組氨酸標(biāo)簽在內(nèi)共編碼 643個氨基酸，相對分子質(zhì)量約為 7.1×104，電泳條帶偏低可能是由于電泳液 pH影響蛋白 SDS載量，從而影響其電泳遷移率．利用透析袋水平電泳法純化的目的蛋白經(jīng) SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，回收蛋白條帶單一、無雜帶，純化效果良好(圖3b)．

圖3 CRY1Ab/Ac蛋白原核表達(dá)與純化Fig.3 Prokaryotic expression and purification of recombined CRY1Ab/Ac protein

3 討 論

Bt基因是目前轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中應(yīng)用極為廣泛的一大類抗蟲基因，本研究從轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1入手，針對其抗蟲Bt基因進(jìn)行全長克隆，利用pET/DE3表達(dá)系統(tǒng)成功富集檢測標(biāo)示物，為今后轉(zhuǎn)基因檢測產(chǎn)品的研發(fā)提供必要前提．

本研究目的蛋白以包涵體形式存在，雖然包涵體易于分離，但其通常需要條件劇烈的變性劑才能溶解，如高濃度的尿素或鹽酸胍，這使得目的蛋白在變性、復(fù)性過程中容易形成沉淀．因此，從包涵體中回收具備活性的目的蛋白非常困難，對后續(xù)的免疫及抗體制備研究存在一定影響．

當(dāng)前，國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因水稻研究領(lǐng)域已取得長足進(jìn)展[6]，我國科研工作者歷經(jīng)多年努力也培育出多個轉(zhuǎn)基因水稻品種[7–10]；但由于轉(zhuǎn)基因食用安全問題的爭論以及公眾的高度關(guān)注，使我國轉(zhuǎn)基因水稻尚未實(shí)現(xiàn)大面積推廣種植．此外，不同國家和地區(qū)的轉(zhuǎn)基因標(biāo)識制度(CAC/GL 44—2003、CAC/GL 45—2003 和CAC/GL 46—2003)也直接關(guān)聯(lián)農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)出口檢驗(yàn)與國際貿(mào)易爭端．例如，歐盟 2006年 9月起多次聲稱中國進(jìn)口大米檢出未經(jīng)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因成分，并對中國出口米制品采取了拒絕入境或撤架、召回等措施，嚴(yán)重影響了我國農(nóng)產(chǎn)品出口．由此可見，轉(zhuǎn)基因檢測需求市場巨大．開發(fā)快速、準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)與方法，不僅可以滿足我國轉(zhuǎn)基因生物監(jiān)管需求，而且對完善轉(zhuǎn)基因標(biāo)識管理制度與保護(hù)國家農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)出口利益等方面均具有重要意義．

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