張翠英，林 雪，孫 溪，肖冬光

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

面包酵母是面食制作過程中必不可少微生物發(fā)酵劑和疏松劑[1–2]．在無糖面團中，麥芽糖是主要的可發(fā)酵糖，因此麥芽糖代謝能力是影響無糖面團中面包酵母發(fā)酵能力的主要因素[3–4]．酵母利用麥芽糖需要 3種基因產(chǎn)物，典型的為 MAL61(MAL6T)編碼的麥芽糖通透酶、MAL62(MAL6S)編碼的麥芽糖酶和

MAL63(MAL6R)編碼的正調(diào)節(jié)蛋白[5]．麥芽糖通透酶將麥芽糖運輸?shù)桨麅?nèi)，經(jīng)麥芽糖酶水解為兩分子葡萄糖后進入糖酵解途徑，供細胞利用．本實驗室[6–7]前期實驗表明，在麥芽糖代謝過程中麥芽糖酶的作用較為關(guān)鍵．因此，提高MAL62基因的表達量是加快麥芽糖代謝、提高面包酵母無糖面團發(fā)酵力的有效途徑．

實際上，在無糖面團中含有少量的葡萄糖、果糖等可發(fā)酵糖，葡萄糖的存在對一些糖代謝相關(guān)基因的表達存在抑制作用，從而降低了其代謝速度[8–9].Mig1蛋白是一種鋅指狀 DNA結(jié)合蛋白，是 SUC2、GAL和 MAL基因的阻遏子[10]，Mig1蛋白復(fù)合體和MAL-激活蛋白(Mal63)之間的復(fù)雜作用被認為是葡萄糖阻遏麥芽糖代謝的主要步驟．Hu等[11]發(fā)現(xiàn)MIG1的破壞或在 MAL63啟動子上 Mig1蛋白結(jié)合位點的敲除會增加MAL63的表達．因此敲除MIG1，去除葡萄糖阻遏效應(yīng)也是提高面包酵母無糖面團發(fā)酵力的另一有效途徑．

本實驗對敲除MIG1同時整合過表達MAL62的面包酵母工業(yè)重組菌 BPM-M 進行了酶活、耗糖、葡萄糖阻遏以及無糖面團發(fā)酵力的測定．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

面包酵母工業(yè)菌株 BY-14由天津科技大學(xué)天津市工業(yè)微生物重點實驗室保藏；BY-14a是親本菌株BY-14的a型單倍體菌株[12]．

質(zhì)粒 pUC-MKAB[12]和 pUC-P[13]由本實驗室前期構(gòu)建、保藏，pUC-P質(zhì)粒攜有釀酒酵母3–磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)強啟動子．

1.1.2 培養(yǎng)基

細菌培養(yǎng)基(LB)：10,g/L胰蛋白胨，5,g/L酵母粉，10,g/L 氯化鈉，pH 7.0．

糖蜜培養(yǎng)基：將30～35,Brix的糖蜜稀釋至10～12,Brix，添加酵母粉 5,g/L、硫酸銨 0.5,g/L，pH 5.0．

酵母培養(yǎng)基(YEPD)：蛋白胨 20,g/L，酵母粉10,g/L，葡萄糖20,g/L．

液體模擬面團培養(yǎng)基(LSMLD)：

(1)葡萄糖 LSMLD：葡萄糖 40,g/L，硫酸銨2.5,g/L，尿素 5,g/L，磷酸二氫鉀 16,g/L，磷酸氫二鈉5,g/L，硫酸鎂 0.6,g/L，煙酸 22.5,mg/L，泛酸5.0,mg/L，維生素 B12.5,mg/L，維生素 B61.25,mg/L，維生素B21.0,mg/L，葉酸0.5,mg/L，蒸餾水配制．

(2)麥芽糖 LSMLD：以 38,g/L麥芽糖代替40,g/L葡萄糖，其他成分不變．

(3)混合糖 LSMLD：以 33.25,g/L 麥芽糖、5,g/L葡萄糖代替40,g/L葡萄糖，其他成分不變．

1.1.3 設(shè)備與儀器

Precellys24細胞破碎儀，法國 Bertin Technologies公司；發(fā)酵力測定儀，瑞典 SJA公司；1100系列高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；SynergyTM,4多功能酶標儀，美國Biotek公司．

1.2 方法

1.2.1 引物

實驗中所用引物見表1．

表1 BPM-M突變株構(gòu)建所用引物Tab.1 Primers used in the construction of the recombined strain BPM-M

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以面包酵母 BY-14a染色體 DNA為模板，利用引物 Mal62-up和 Mal62-down PCR擴增目的基因MAL62；將 MAL62插入到 pUC-P質(zhì)粒的 XhoI酶切位點，得到質(zhì)粒 pUC-PM；以 pUC-PM 為模板，利用引物PGK-up和PGK-down PCR擴增PM片段，連接到 pUC-MKAB質(zhì)粒 BamHI酶切位點，構(gòu)建質(zhì)粒pUC-MKABM．

1.2.3 醋酸鋰方法轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化子的鑒定

以質(zhì)粒 pUC-MKABM 為模板，用引物 MA-up和 MB-down進行 PCR擴增，得到 MA-KanMX-(PGK1P＋MAL62＋PGK1T)-MB重組盒；通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[7]將重組盒轉(zhuǎn)化酵母單倍體 BY-14a．轉(zhuǎn)化后的細胞涂布于含有 G-418的 YEPD平板，30,℃培養(yǎng)48,h．獲得的轉(zhuǎn)化子再通過PCR進行驗證．

1.2.4 鮮酵母的制備

挑取 1環(huán)酵母菌接種于5,mL的 YEPD液體培養(yǎng)基中，30,℃靜置培養(yǎng) 36,h，間歇搖動；以 10%接種量接入糖蜜培養(yǎng)基，30,℃、180,r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期，靜置2,h使酵母狀態(tài)利于下一步發(fā)酵；4,000,r/min離心5,min，洗滌2次后收集菌體備用．

1.2.5 糖蜜處理

廢糖蜜先用硫酸調(diào)糖蜜 pH至 4.5(添加量約為糖蜜質(zhì)量的 0.5%)，加熱至沸騰后保持0.5～1,h以驅(qū)除有害氣體；待晾涼后加石灰乳調(diào)節(jié)pH至5.0，使雜質(zhì)沉淀排除；靜置24,h以上，過濾取上清液．

1.2.6 酶活力測定

按照參考文獻[14]進行麥芽糖酶活力的測定．每個實驗重復(fù) 3次，取平均值．麥芽糖酶活力單位為每分鐘每毫克蛋白釋放對硝基苯酚的物質(zhì)的量(μmol/(min·mg))．

1.2.7 殘?zhí)堑臏y定

配制LSMLD培養(yǎng)基，100,℃煮沸30,min后冷卻至 30,℃．每 100,mL LSMLD 培養(yǎng)基接入 2,g鮮酵母，30,℃靜置培養(yǎng) 4,h．每隔一定時間取樣，–20,℃保存，待發(fā)酵完畢進行一次性測定．葡萄糖與麥芽糖含量測定采用高效液相色譜法[7]．高效液相色譜條件為：Bio-Red的 Aminex HPX-87H 色譜柱(300,mm×7.8,mm，9,μm)，流動相為 5,mmol/L 的稀硫酸，流量為 0.6,mL/min，柱溫為 65,℃，檢測器為示差折光檢測器，檢測器溫度為 45,℃．樣品稀釋到合適的質(zhì)量濃度(低于1.000,g/L)并用0.22,μm的濾膜過濾，進樣量為 20,μL．

1.2.8 葡萄糖阻遏程度的測定

在混合糖模擬面團培養(yǎng)基中，以葡萄糖含量由0.5%降至 0.1%時所消耗的總糖量算作酵母的總糖利用量，計為u1(mmol)；再計算相同時間內(nèi)單麥芽糖模擬面團培養(yǎng)基中麥芽糖的消耗量，計為u2(mmol)；由式(1)可以計算出葡萄糖的阻遏程度I,[12]．

1.2.9 無糖面團發(fā)酵力的測定

面團發(fā)酵力根據(jù)GB/T 20886—2007《食品加工用酵母》[15]的方法測定：面粉 280,g、水 150,mL、氯化鈉4,g和鮮酵母(含水量75%)9,g在(30±0.2)℃條件下快速均勻攪拌 5,min，放入發(fā)酵力測定儀，記錄30,℃下90,min內(nèi)的CO2產(chǎn)氣量．實驗重復(fù)3次取平均值．

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌株BPM-M的構(gòu)建

將 MA-KanMX-(PGK1P＋MAL62＋PGK1T)-MB重組盒轉(zhuǎn)化酵母單倍體 BY-14a，同源重組過程如圖1所示．獲得的G-418抗性轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR驗證，結(jié)果如圖2所示．

圖1 同源重組過程Fig.1 Homologous recombining process

在重組菌株 BPM-M 基因組上，利用 3對引物M-S/M-X、M-S/K-S-B、M-X/PGK1T(IN)-up 都能夠PCR擴增分別得到明顯的一條片段，大小與預(yù)期結(jié)果(6,470,bp、2,454,bp和 533,bp)一致；而利用引物M-S/K-S-B和 M-X/PGK1T(IN)-up在親本菌株 BY-14a基因組上則不能 PCR擴增獲得明顯片段．這些結(jié)果證明，在重組菌株 BPM-M 基因組上，重組盒MA-KanMX-(PGK1P＋MAL62＋PGK1T)-MB 重組整合正確．

圖2 重組菌株BPM-M基因組驗證Fig.2 Verification of the recombined strain BPM-M

2.2 發(fā)酵性能

2.2.1 酶活力

不同碳源 LSMLD培養(yǎng)基中菌株 BY-14a和BPM-M的麥芽糖酶活力如圖3所示．

圖3 不同碳源 LSMLD培養(yǎng)基中菌株 BY-14a和 BPMM的麥芽糖酶活力Fig.3 Maltase activity of BY-14a and BPM-M in LSMLD medium of different carbon sources

在3種不同碳源LSMLD培養(yǎng)基中，與親本菌株BY-14a相比，整合過表達 MAL62基因的重組菌BPM-M，其麥芽糖酶活力均有提高．在混合糖LSMLD培養(yǎng)基中，盡管存在一定程度的葡萄糖阻遏效應(yīng)，但重組菌BPM-M最大麥芽糖酶活力比親本菌株 BY-14a高 42.9%；在麥芽糖 LSMLD培養(yǎng)基中，BPM-M 的最大麥芽糖酶活力比親本菌株 BY-14a高49.3%；在葡萄糖LSMLD培養(yǎng)基中，盡管兩菌株的麥芽糖酶活力均低于 0.5,μmol/(min·mg)，但是重組菌BPM-M 的最大麥芽糖酶活力仍然高出親本菌 BY-14a 100.0%．這些結(jié)果證明整合過表達 MAL62使重組菌株麥芽糖酶活力顯著提高，從而提高菌株在細胞內(nèi)分解麥芽糖的能力．

2.2.2 液體模擬面團培養(yǎng)基中的殘?zhí)羌捌咸烟亲瓒舫潭?/p>

通過 HPLC測定了混合 LSMLD培養(yǎng)基中葡萄糖和麥芽糖濃度隨時間的變化，結(jié)果如圖4所示．

圖4 混合糖 LSMLD培養(yǎng)基中菌株 BY-14a和 BPM-M的麥芽糖及葡萄糖殘?zhí)琴|(zhì)量濃度Fig.4 Concentration of residual maltose and glucose of BY-14a and BPM-M during shaking cultivation in maltose-glucose LSMLD media

經(jīng)過一級培養(yǎng)，兩菌株在接入麥芽糖與葡萄糖為碳源的混合糖LSMLD模擬面團培養(yǎng)基后，均立即出現(xiàn)麥芽糖與葡萄糖共同吸收的現(xiàn)象．然而在親本菌株BY-14a中麥芽糖的吸收因為葡萄糖的存在延滯了一段時間．在重組菌株BPM-M中葡萄糖利用速率顯著加快，同時葡萄糖阻遏現(xiàn)象明顯減輕，麥芽糖利用速率明顯加快，發(fā)酵240,min麥芽糖利用速率較親本提高29.1%. 同時，通過式(1)計算得到兩菌株的葡萄糖阻遏程度. 親本菌株 BY-14a受葡萄糖阻遏程度為 59%，重組菌株 BPM-M 受葡萄糖阻遏程度為36.1%．與親本菌株 BY-14a相比，重組菌株 BPM-M的葡萄糖阻遏程度降低了 38.8%．這些結(jié)果證明，面包酵母重組菌株 BPM-M 具有較高的抗葡萄糖阻遏能力、較快的麥芽糖利用能力．Klein等[16]將敲除MIG1、表達 MALT、MALS以及敲除 MIG1同時表達MALT、MALS的 3株釀酒酵母重組菌株分別與親本菌株比較發(fā)現(xiàn)：在葡萄糖存在時，3株重組菌的葡萄糖阻遏明顯減弱，麥芽糖利用速率均有明顯提高，甚至表達MAL的重組菌對麥芽糖攝取已經(jīng)超過對葡萄糖的攝?。狙芯拷Y(jié)果則證明敲除 MIG1僅同時過表達一個麥芽糖利用的酶——麥芽糖酶編碼基因MAL62(MALS)就可以使面包酵母葡萄糖阻遏作用減弱，麥芽糖利用速率提高．2.2.3 無糖面團發(fā)酵力

面團發(fā)酵力根據(jù)單位干質(zhì)量的菌體在單位時間內(nèi)產(chǎn)生 CO2的體積確定．不同菌在無糖面團中的CO2產(chǎn)量如圖5所示．

圖5 不同菌在無糖面團中的CO2產(chǎn)量Fig.5 CO2 production of the strains in lean dough

親本菌株BY-14a在80,min時 CO2產(chǎn)量達到最大，無糖面團發(fā)酵力為(108.5±0.3)mL/(h·g)．而重組菌株BPM-M在發(fā)酵50,min時就可以達到同等效力，且最大產(chǎn)氣量較親本菌株BY-14a提高10.2%，其無糖面團發(fā)酵力為(163.4±0.8)mL/(h·g)，比親本菌株提高了50.6%．該結(jié)果表明，面包酵母重組菌株BPM-M 具有較高的麥芽糖利用能力，可以在較短的時間內(nèi)獲得較大的 CO2產(chǎn)量．Higgins等[4]在對麥芽糖酶活力與麥芽糖通透酶活力對“遲滯”與“非遲滯”面包酵母產(chǎn)氣能力的探究中發(fā)現(xiàn)，酶活力與CO2產(chǎn)量兩者之間有關(guān)聯(lián)性，麥芽糖酶活力的提高使產(chǎn)氣量也明顯增加，這與本研究結(jié)果一致．

3 結(jié) 論

本實驗利用同源重組的原理，在面包酵母菌株中實現(xiàn)了敲除 MIG1基因同時過表達 MAL62基因．面包酵母重組菌株 BPM-M 具有較高的麥芽糖利用能力和無糖面團發(fā)酵力．敲除MIG1僅同時過表達一個麥芽糖利用的酶——麥芽糖酶編碼基因MAL62就可以使面包酵母葡萄糖阻遏作用減弱、麥芽糖利用速率提高、無糖面團發(fā)酵力提高．

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