吳方紅+戈偉+周學(xué)軍+鄭永法+文靜

[摘要] 目的 探討青蒿琥酯對(duì)大胃癌細(xì)胞系HGC27細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制。 方法 體外培養(yǎng)HGC27細(xì)胞，采用不同濃度青蒿琥酯處理24、48、72 h，MTT法測(cè)定其對(duì)HGC27細(xì)胞增殖的影響；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；青蒿琥酯（濃度分別為20、40、80 mg/L）處理HGC27細(xì)胞48 h后，分別采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡、分光光度計(jì)檢測(cè)Casepase-3、Caspase-9相對(duì)活性、Western blot法檢RUNX-3蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果 青蒿琥酯（濃度10～100 mg/L）能抑制HGC27細(xì)胞的增殖，呈劑量和時(shí)間依賴性；倒置顯微鏡下可觀察到典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)。青蒿琥酯（濃度分別為20、40、80 mg/L）作用HGC27細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率分別為11.5%、21.4%、36.6%，而對(duì)照組凋亡率僅為2.2%；處理后Casepase-3相對(duì)活性分別為（0.19±0.02）、（0.25±0.04）和（0.31±0.03），對(duì)照組為（0.11±0.02），Casepase-9相對(duì)活性分別為（0.18±0.02）、（0.23±0.03）和（0.30±0.04），對(duì)照組為（0.10±0.02），與對(duì)照組比較，青蒿琥酯處理組Casepase-3、Caspase-9相對(duì)活性顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）；RUNX-3蛋白表達(dá)上調(diào)，呈劑量依賴性。 結(jié)論 青蒿琥酯能抑制HGC27細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其作用機(jī)制可能與增加細(xì)胞Casepase-3、Caspase-9活性、上調(diào)RUNX-3蛋白的表達(dá)有關(guān)。青蒿琥酯是一種前景廣闊的抗腫瘤藥物。

[關(guān)鍵詞] 青蒿琥酯；HGC27細(xì)胞；Caspase-3；Caspase-9；人類相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）02（b）-0009-04

Effects of artesunate on cell proliferation and apoptosis in human gastric cancer HGC27 cells and its mechanisms

WU Fanghong GE Wei ZHOU Xuejun ZHENG Yongfa WEN Jing

Department of Oncology， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of artesunate on cell proliferation and apoptosis in gastric cancer line HGC27 cells and discuss its possible mechanisms. Methods HGC27 cells were cultured in vitro. After treatment by artesunate at different concentrations respectively at 24， 48， 72 h， the cell survival was determined by the MTT method. The changes of cell morphology were observed by inverted microscope. After 48 h treatment by artesunate （20， 40， 80 mg/L）， the HGC27 cell apoptosis was detected by flow cytometry， the relative activity of Caspase-3 and Caspase-9 was monitored by spectrophotometer， the change of protein expression of RUNX-3 was detected by western blot. Results From the data of MTT， the cell proliferation of human gastricl cancer HGC27 cells was inhibited by artesunate （10-100 mg/L） in a dose-dependent and time-dependent manner. Typical apoptosis morphology of HGC27 cells was observed by inverted microscope. Flow cytometry assays showed that artesunate significantly induced apoptosis in HGC27 cells. After treated with artesunate （20， 40， 80 mg/L）， the apoptosis rate of HGC27 cells was 11.5%， 21.4% and 36.6% respectively， which showed an obvious concentration-effect relationship， while the apoptosis rate of HGC27 cells was 2.2% in the control group. The relative activity of Caspase-3 of artesunate group was （0.19±0.02）， （0.25±0.04） and （0.31±0.03） respectively， which was significantly increased than the control group （0.11±0.02） （P < 0.05）. And the relative activity of Caspase-9 of artesunate group was （0.18±0.02）， （0.23±0.03） and （0.30±0.04）， which was significantly increased than the control group （0.10±0.02） （P < 0.05）. The data of Western blot showed that artesunate up-regulated RUNX-3 in a dose-dependent manner. Conclusion Artesunate can inhibit the proliferation of HGC27 cells and induce apoptosis， and the mechanism of artesunate on apoptosis may be related to the up-regulation of RUNX-3 expression， as well as the increase of relative activity of Caspase-3 and Caspase-9. Artesunate may be a promising antitumor agent for gastric cancer treatment.

[Key words] Artesunate； HGC27 cell； Caspase-3； Caspase-9； RUNX-3

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，胃癌死亡率居腫瘤相關(guān)死亡率前列[1]。我國(guó)胃癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人民群眾的生命健康。胃癌治療方法以手術(shù)切除為主，輔以化療，但常規(guī)的化療藥物毒性大且常出現(xiàn)耐藥性，因此尋找有效且毒副作用小的抗腫瘤藥已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。青蒿素及其衍生物是我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高效速效抗瘧藥物。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素及其衍生物除了有抗瘧作用外，還對(duì)人類多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的殺傷或抑制作用[2-4]，但具體機(jī)制尚不十分清楚。為探討青蒿素衍生物之一青蒿琥酯的抗癌機(jī)制，本研究以人胃癌HGC27細(xì)胞為對(duì)象，觀察青蒿琥酯對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)人胃癌細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性變化及抑癌基因人類相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（human runt-related transcription factor 3，RUNX3）表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細(xì)胞HGC27細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；青蒿琥酯購(gòu)于桂林南藥股份有限公司；AnnexinV/PI試劑盒購(gòu)于BENDER公司；胎牛血清購(gòu)自Invitrogen公司；RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)于杭州四季青生物材料研究所；胎牛血清系GIBCO產(chǎn)品；MTT試劑盒購(gòu)于武漢谷歌生物科技有限公司；Caspase-3、Caspase-9活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；RUNX-3單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HGC27細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液中（含10%小牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素），置于37℃，飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，根據(jù)生長(zhǎng)情況3～5 d傳代一次。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HGC27細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，以1×104/mL的濃度接種于96孔板，每孔200 μL，待細(xì)胞貼壁后分組：青蒿琥酯組加入青蒿琥酯終濃度為10、20、40、80、100 mg/L的培養(yǎng)液，對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)液，并設(shè)立調(diào)零孔。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h加入MTT試劑20 μL/每孔，繼續(xù)孵育4 h，小心吸掉上清，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀上檢測(cè)每孔在570 nm處的吸光值（A值）。抑制率=[1-（實(shí)驗(yàn)組平均A值-調(diào)零孔A值）/（對(duì)照組平均A值-調(diào)零孔A值）]×100%。

1.2.3 顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化傳代并培養(yǎng)24 h后，換青蒿琥酯終濃度為10、20、40、80、100 mg/L的培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×106/mL濃度接種于6孔培養(yǎng)板中，貼壁后分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別加入青蒿琥酯終濃度為20、40、80 mg/L的培養(yǎng)液，對(duì)照組加入等量培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，離洗固定后加入Annexin V-FITC 和PI染色。篩網(wǎng)過(guò)濾送流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 分光光度法檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9活性變化 細(xì)胞接種及分組同“1.2.4”項(xiàng)下，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，分別加入50 μL冷裂解緩沖液，冰浴裂解15 min，然后4℃，1200 r/min離心15 min，將上清移至預(yù)冷的離心管中，置于冰上，取5 μL用BCA法測(cè)定蛋白濃度，取50 μL調(diào)好蛋白濃度（2～4 g/L），加入20 μL反應(yīng)緩沖液吹打均勻，加入5 μL Caspase-3、Caspase-9反應(yīng)底物Ac-DEVD-pNA和Ac-LEHD-pNA，細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育4 h，酶標(biāo)儀上405 nm處測(cè)定吸光度（OD405）。

1.2.6 Western blot法檢測(cè)RUNX-3 蛋白表達(dá)變化 細(xì)胞接種及分組同“1.2.4”項(xiàng)下，收集細(xì)胞，用PBS漂洗，參照細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，提取細(xì)胞總蛋白，并測(cè)定蛋白濃度，蛋白樣品加入1/5體積的5×上樣緩沖液，沸水煮沸5 min后離心，以每孔20 μg上樣，行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入1∶1000稀釋的兔抗人RUNX-3蛋白，4℃過(guò)夜，β-actin作為內(nèi)參，TBST洗膜3次，加入1∶1000稀釋的辣根酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG，室溫孵育2 h，同樣洗膜3次，ECL顯色，觀察各條帶深淺變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有資料經(jīng)SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 青蒿琥酯對(duì)HGC27細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示，青蒿琥酯在不同濃度和不同作用時(shí)間均能顯著抑制HGC27細(xì)胞增殖（P < 0.05），且隨著青蒿琥酯濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈明顯的濃度和時(shí)間依賴效應(yīng)（圖1）。

2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察

倒置顯微鏡下可見對(duì)照組HGC27細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，折光率較高，胞體大，形態(tài)成梭形或多邊形，胞質(zhì)均勻透明，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)形態(tài)無(wú)明顯變化。青蒿琥酯處理的細(xì)胞增殖減慢，且隨著青蒿琥酯濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸變小、變圓，折光率減弱，核濃縮等，部分脫落漂浮于培養(yǎng)瓶中，但細(xì)胞膜完整，最后裂解。青蒿琥酯濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，上述表現(xiàn)越明顯，漂浮細(xì)胞越多。

2.3 青蒿琥酯對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度（20、40、80 mg/L）青蒿琥酯處理HGC27細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率分別為11.5%、21.4%、36.6%，而對(duì)照組凋亡率僅為2.2%，表明青蒿琥酯能誘導(dǎo)HGC27細(xì)胞凋亡（圖2）。

A： 對(duì)照組； B： 20 mg/L青蒿琥酯處理組； C： 40 mg/L青蒿琥酯處理組； D： 80 mg/L青蒿琥酯處理組

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)HGC27細(xì)胞凋亡率的影響

2.4 青蒿琥酯對(duì)Caspase-3、Caspase-9活性的影響

Caspase-3、Caspase-9活性檢測(cè)示，20、40、80 mg/L青蒿琥酯作用HGC27細(xì)胞48 h后，Caspase-3相對(duì)活性明顯升高，分別為（0.19±0.02）、（0.25±0.04）和（0.31±0.03），與對(duì)照組（0.11±0.02）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；Caspase-9活性亦明顯升高，分別為（0.18±0.02）、（0.23±0.03）和（0.30±0.04），與對(duì)照組（0.10±0.02）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），表明青蒿琥酯能活化Caspase-3、Caspase-9。

2.5 青蒿琥酯對(duì)RUNX-3蛋白表達(dá)的影響

青蒿琥酯處理HGC27細(xì)胞48 h后，結(jié)果顯示隨著青蒿琥酯濃度的升高，RUNX-3蛋白表達(dá)量也逐漸升高，見圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)HGC27細(xì)胞

RUNX3 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的自我調(diào)節(jié)機(jī)制[5]，細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖之間的平衡在胃癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6]，細(xì)胞凋亡是程序化、多基因調(diào)控的細(xì)胞死亡過(guò)程，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已經(jīng)成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯在10～100 mg/L濃度范圍，對(duì)人胃癌HGC27細(xì)胞的增殖均有抑制作用，隨著藥物濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制細(xì)胞增殖的作用亦逐步增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的濃度效應(yīng)及時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。青蒿琥酯處理HGC27細(xì)胞后，在倒置顯微鏡下均可見到凋亡細(xì)胞的形態(tài)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)其細(xì)胞凋亡率隨著青蒿琥酯處理濃度的增加而升高，呈明顯的劑量依賴效應(yīng)。表明青蒿琥酯可抑制胃癌HGC27細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。

在細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究中，目前認(rèn)為主要由3條信號(hào)途徑：線粒體途徑、死亡受體途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。Caspase家族的激活在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，被認(rèn)為是引起凋亡的直接效應(yīng)物。Caspase-9是線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵蛋白酶，處于Caspase“瀑布式”激活的頂端，它的活化對(duì)線粒體凋亡通路尤為重要，并進(jìn)一步激活Caspase-3，Caspase-3活化后可裂解DNA修復(fù)相關(guān)分子、凋亡抑制蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和骨架蛋白等，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Caspase-3是凋亡過(guò)程的主要效應(yīng)分子，其活化標(biāo)志著凋亡進(jìn)入不可逆階段[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯處理HGC27細(xì)胞48 h后，細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性明顯升高，并呈明顯濃度依賴效應(yīng)，提示青蒿琥酯可能通過(guò)激活Caspase-3、Caspase-9級(jí)聯(lián)的線粒體依賴性途徑誘導(dǎo)人胃癌HGC27細(xì)胞凋亡。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯能上調(diào)HGC27細(xì)胞中RUNX3基因表達(dá)，且表達(dá)量隨著藥物濃度的升高而增加，呈明顯濃度效應(yīng)。大量研究證明，轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor，TGF-β）和Wnt信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[8-9]。RUNX3參與TGF-β信號(hào)通路誘導(dǎo)生長(zhǎng)抑制的過(guò)程[10]。研究證實(shí)，RUNX3基因在多種腫瘤如乳腺癌、胃癌、大腸癌、肝癌及肺癌中表達(dá)下調(diào)甚至缺失，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[11-12]。有證據(jù)表明，恢復(fù)RUNX3基因的表達(dá)能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及下調(diào)cyclin D1的表達(dá)而顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[13]。前期研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯能將腫瘤細(xì)胞阻滯于G1期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14-15]。且RUNX3基因表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)與流式細(xì)胞儀檢測(cè)的凋亡率增升高趨勢(shì)是一致的。因此，提示青蒿琥酯能通過(guò)上調(diào)RUNX3基因表達(dá)影響細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯在體外能抑制大胃癌HGC27細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，可能的機(jī)制是上調(diào)抑癌基因RUNX-3表達(dá)及增強(qiáng)Caspase-3、Caspase-9活性。腫瘤的凋亡是一個(gè)復(fù)雜而又精確調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，盡管青蒿琥酯抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制還有待于進(jìn)一步探索和研究來(lái)闡明，筆者相信青蒿琥酯在抗腫瘤方面具有廣闊前景，并期待包括青蒿琥酯在內(nèi)的青蒿素及其衍生物能成為高效低度的抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床。

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（收稿日期：2013-10-26 本文編輯：程 銘）

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（收稿日期：2013-10-26 本文編輯：程 銘）

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（收稿日期：2013-10-26 本文編輯：程 銘）