王萬(wàn)宏，王亞林，盧慶韜

自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)腦出血患者血清S100β、GFAP的影響

王萬(wàn)宏1，王亞林1，盧慶韜2

（1.唐山市豐南區(qū)醫(yī)院神經(jīng)外科，河北唐山063300；2.唐山市工人醫(yī)院分院外科）

非創(chuàng)傷性腦出血最常見(jiàn)的原因?yàn)楦哐獕盒阅X出血。長(zhǎng)期的高血壓導(dǎo)致腦動(dòng)脈粥樣硬化，腦動(dòng)脈粥樣斑塊形成。當(dāng)遇誘發(fā)因素存在時(shí)，血壓驟然升高，從而導(dǎo)致腦出血發(fā)生。大多數(shù)腦出血患者都有腦組織損傷和神經(jīng)功能缺損。促進(jìn)受損腦組織修復(fù)是當(dāng)前腦出血治療的主要任務(wù)。以往研究表明，自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）移植能改善神經(jīng)功能缺損程度并提高日常生活活動(dòng)能力［1，2］，但對(duì)腦出血患者腦組織損傷血清標(biāo)志物的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究觀察自體MSCs移植對(duì)腦出血患者血清S100β、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的影響，為腦出血的臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料

選擇2010年1月－2013年7月我院收治的腦出血患者60例為研究對(duì)象，均行鉆孔引流術(shù)，術(shù)后1周行自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植30例為觀察組，行常規(guī)治療30例為對(duì)照組。觀察組：男18例，女12例；年齡40.5－68.0歲，平均年齡（54.0±6.5）歲；CT定位出血均為基底核區(qū)；出血量：20－30ml 10例，30－50ml 13例，＞50ml 7例；患肢肌力0級(jí)9例，Ⅰ－Ⅱ級(jí)12例，Ⅲ－Ⅳ級(jí)9例。對(duì)照組：男19例，女11例；年齡41.0－67.5歲，平均年齡（54.3±6.2）歲；CT定位出血均為基底核區(qū)；出血量：20－30ml 9例，30－50ml 13例，＞50ml 8例；患肢肌力0級(jí)10例，Ⅰ－Ⅱ級(jí)11例，Ⅲ－Ⅳ級(jí)9例。兩組患者性別、年齡、出血部位、出血量、患肢肌力等資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＜80歲，發(fā)病后有失語(yǔ)、偏癱、運(yùn)動(dòng)障礙等神經(jīng)功能缺損癥狀；②有鉆孔引流手術(shù)指征；③取得患者家屬的知情同意，并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥80歲，有嚴(yán)重過(guò)敏史的過(guò)敏體質(zhì)者；②合并心、肝、腎等其他臟器嚴(yán)重功能障礙者；③凝血機(jī)制障礙者；④對(duì)MSCs移植治療期望過(guò)高，有不切實(shí)際要求者。

1.3骨髓采集

患者進(jìn)手術(shù)室于局部麻醉下行骨髓穿刺術(shù)，以髂后上棘為穿刺點(diǎn)，30號(hào)骨髓穿刺針進(jìn)行穿刺，20 ml干燥無(wú)菌注射器于兩側(cè)髂后上棘共抽取120－180 ml骨髓，注入細(xì)胞培養(yǎng)液中，迅速送至無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)室。骨髓穿刺術(shù)后將患者送入ICU重癥監(jiān)護(hù)室，注意監(jiān)測(cè)生命體征［3］。

1.4MSCs的分離和培養(yǎng)

MSCs分離：無(wú)菌采集抗凝骨髓120－180ml；消毒采血袋壁及輸液管，將試劑A液、B液均加至骨髓液中，靜置40min；吸取上層液體轉(zhuǎn)移至離心管，以1 500rpm轉(zhuǎn)速離心10min；棄上清，將適量C液加入各離心管中，吹打混勻細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，離心10min；用吸管將細(xì)胞層轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入適量A液，以1 500rpm轉(zhuǎn)速離心5min；棄上清，以1 800rpm離心5min；吸取少量細(xì)胞懸液，滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。MSCs培養(yǎng)：調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×107／ml接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，含5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱；培養(yǎng)至第4d，去除未貼壁的懸浮死細(xì)胞，換完全細(xì)胞培養(yǎng)液；每3d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)瓶底面積的80－90%時(shí)，加入含0.25%胰蛋白酶的消化液2ml至培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱消化約1min，取出培養(yǎng)瓶，顯微鏡下觀察，見(jiàn)細(xì)胞收縮成類圓形的細(xì)胞，加入中和胰蛋白酶3ml于培養(yǎng)液中，以防過(guò)度消化。把溶液倒入離心管中，加入完全培養(yǎng)液反復(fù)吹打，吸棄氣泡，以1 500rpm轉(zhuǎn)速離心5min，棄上清，反復(fù)吹打后，加入完全培養(yǎng)液5ml，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×105／ml，移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)5－7d。按1∶2比例傳代，2－3d換液一次，期間觀察待細(xì)胞基本融合后，用0.25%胰蛋白酶5ml溶解，往培養(yǎng)液中加入完全培養(yǎng)液，吹打制備單細(xì)胞懸液［4］。

1.5 MSCs的移植

患者躺于平板床上，取左側(cè)臥位，屈髖屈膝，頭盡量曲向前胸，背部與床面垂直；穿刺點(diǎn)選擇3－4腰椎棘突間隙。常規(guī)消毒，鋪無(wú)菌洞巾，以2%利多卡因3ml行局部浸潤(rùn)麻醉，麻醉至椎間韌帶，以9號(hào)穿刺針以垂直背部方向自穿刺點(diǎn)刺入約5cm左右，待針尖抵抗感消失，緩慢拔出針芯。無(wú)色透明的腦脊液流出表示穿刺成功，將MSCs細(xì)胞懸液5ml緩慢注入蛛網(wǎng)膜下腔，穿入針芯，拔出穿刺針，無(wú)菌紗布覆蓋，膠布固定，囑患者去枕平臥6h。

1.6血清S100β、GFAP檢測(cè)方法

采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清S100β、GFAP，試劑盒均購(gòu)自北京尚柏生物工程公司，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。具體步驟：自密封袋中取出ELISA板并標(biāo)記；分別加入10μl標(biāo)準(zhǔn)品、10μl血清于板孔中，輕輕混勻，每孔加入200μl抗體，混勻30s，37℃溫育30min；洗滌反應(yīng)板5次，每孔加入100μl HRP，混勻10s，37℃溫育30min；洗滌反應(yīng)板5次，每孔加入200μl TNB顯色液，混勻后室溫溫育20min；每孔加入100μl終止液，輕輕混勻30s，30min內(nèi)在450nm處讀OD值；制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定血清樣品S100β、GFAP濃度。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x—±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1自體MSCs移植對(duì)腦出血患者血清S100β的影響對(duì)照組和觀察組患者血清S100β蛋白含量在干預(yù)1d、4d、7d均呈遞減趨勢(shì)（P＜0.05）；干預(yù)前及干預(yù)后1d觀察組患者血清S100β蛋白與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，干預(yù)后4d、7d值均低于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 自體MSCs移植對(duì)腦出血患者血清S100β的影響（x—±s，n＝30）

2.2自體MSCs移植對(duì)腦出血患者血清GFAP的影響兩組干預(yù)后1d、4d、7d血清GFAP呈時(shí)間依賴性降低（P＜0.05）；觀察組干預(yù)后4d、7d血清GFAP值均低于對(duì)照組，見(jiàn)表2。

3 討論

腦出血發(fā)病率較高，占急性腦血管疾病的20%－ 30%，其中高血壓性腦出血是非創(chuàng)傷性腦出血的最常見(jiàn)原因。研究表明，在腦出血早期階段，某些血清生化標(biāo)志物可用來(lái)判斷神經(jīng)功能損害程度及范圍，甚至優(yōu)于CT及MRI等影像學(xué)檢查［5］。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布最廣的細(xì)胞，不僅能支持、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元，而且參與宿主防御及組織修復(fù)。GFAP為星形膠質(zhì)細(xì)胞中的主要的中間絲蛋白［6］。S100β蛋白存在于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星型細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞中。當(dāng)中樞神經(jīng)受損時(shí)，S100β和GFAP溢出并通過(guò)血腦屏障進(jìn)入血液。兩者參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的病理變化，可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷早期病情監(jiān)測(cè)的血清標(biāo)志物。

表2 自體MSCs移植對(duì)腦出血患者血清GFAP的影響（x—±s，n＝30）

MSCs來(lái)源于中胚層，是一種多潛能干細(xì)胞，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或創(chuàng)傷修復(fù)具有一定作用。李計(jì)成［7］等對(duì)20例腦出血患者實(shí)施自體MSCs移植，發(fā)現(xiàn)移植后6個(gè)月患者神經(jīng)功能缺損程度評(píng)定（NIHSS評(píng)分）和日常生活活動(dòng)能力評(píng)定（Barthel指數(shù)）均明顯提高，且具有安全性。朱建新［8］對(duì)32例腦出血患者進(jìn)行自體MSCs移植治療，證實(shí)其對(duì)腦出血患者安全可行，近期療效確定。本研究進(jìn)一步觀察自體MSCs移植對(duì)腦出血患者血清S100β、GFAP的影響，結(jié)果顯示：①觀察組在腦出血1周接受自體MSCs移植后1d、4d、7d血清S100β蛋白依次降低，每一時(shí)間點(diǎn)S100β蛋白均低于對(duì)照組水平；②兩組干預(yù)后1d、4d、7d血清GFAP呈時(shí)間依賴性降低；觀察組干預(yù)后1d、4d、7d血清GFAP值均低于對(duì)照組。研究結(jié)果在分子水平證實(shí)，自體MSCs移植能減少血清神經(jīng)細(xì)胞損傷標(biāo)志物S100β、GFAP的水平，間接表明MSCs移植存活后，可多向分化為神經(jīng)細(xì)胞，發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)組織修復(fù)、神經(jīng)功能恢復(fù)的作用。

綜上所述，MSCs不僅取材方便，無(wú)免疫原性，而且體外擴(kuò)增迅速、可自體移植。能通過(guò)降低腦出血患者血清S100β、GFAP水平，促進(jìn)腦出血患者神經(jīng)細(xì)胞損傷的修復(fù)。

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