孫 健，陳軍浩，張 葵，曹小利

乙型病毒性肝炎肝硬化、原發(fā)性肝癌患者外周血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞檢測(cè)

孫 健，陳軍浩，張 葵＊，曹小利

（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京210008）

目的檢測(cè)乙肝肝硬化、原發(fā)性肝癌患者外周血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（Breg）的比率，了解Breg與肝硬化、肝癌疾病之間的關(guān)系。方法以CD19＋CD5＋CD1d＋作為Breg標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)24例乙肝肝硬化患者、28例肝癌患者和20名健康對(duì)照者外周血Breg占B淋巴細(xì)胞的比率。結(jié)果肝硬化患者組Breg比率（29.90±9.19）%和肝癌患者組Breg比率（31.34±8.99）%均顯著高于健康對(duì)照組（22.50±6.52）%，分別為P＝0.016和P＝0.003；肝硬化患者組和肝癌患者組間Breg比率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論與對(duì)照組比較，Breg比率在肝硬化、肝癌患者外周血中顯著升高，提示Breg細(xì)胞增加，與肝硬化、肝癌B細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)紊亂相關(guān)。

調(diào)節(jié)性B細(xì)胞；乙型肝炎；肝硬化；原發(fā)性肝癌；流式細(xì)胞術(shù)

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1975）

乙型肝炎病毒（HBV）持續(xù)感染是引起乙肝慢性化遷延化及肝硬化（liver cirrhosis，LC）的主要原因，原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）與由HBV長(zhǎng)期感染導(dǎo)致的大結(jié)節(jié)性肝硬化有著直接的密切關(guān)系。在我國(guó)，感染HBV的人群中有10%－20%五年內(nèi)將發(fā)展成肝硬化［1］，90%的原發(fā)性肝癌發(fā)生在肝炎肝硬化的基礎(chǔ)上，其中95%肝癌患者具有HBV感染背景。B淋巴細(xì)胞參與調(diào)控和（或）誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答而與肝硬化、肝癌疾病關(guān)系密切［2－5］，調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（regulatory B cell，Breg）作為B淋巴細(xì)胞亞群，其表型CD19＋CD5＋CD1d＋得到國(guó)際公認(rèn)［6］。Breg近年來廣受關(guān)注，其主要功能是調(diào)節(jié)炎癥過程，抑制過度炎癥反應(yīng)，是免疫排斥、自身免疫病及免疫功能紊亂狀態(tài)下的重要的保護(hù)性細(xì)胞，同時(shí)也參與腫瘤、感染性疾病的免疫調(diào)節(jié)，目前在多種疾病中已見Breg的相關(guān)報(bào)道，但Breg與肝硬化、肝癌疾病的關(guān)系未見報(bào)道。本文通過對(duì)乙肝肝硬化、原發(fā)性肝癌患者外周血Breg亞群檢測(cè)，進(jìn)一步了解Breg在肝硬化、肝癌疾病中的作用。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象24例乙肝肝硬化患者和28例原發(fā)性肝癌患者為南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院已確診的住院患者。乙肝肝硬化患者男性19例；女性5例，年齡26－72歲，平均年齡53歲，其中HBsAg，HBeAg，HBcAb陽性7例；HBsAg，HBeAb，HB－cAb陽性14例；HBsAg，HBcAb陽性3例，所有患者均經(jīng)肝組織病理活檢以及經(jīng)臨床、生化和影像學(xué)診斷明確確診為L(zhǎng)C。原發(fā)性肝癌患者男性18例；女性10例，年齡34－76歲，平均年齡56歲，其中19例患者AFP＞1 000ng／ml；6例患者AFP＝20－1 000ng／ml；3例患者AFP＜20ng／ml，所有患者均有LC病史，經(jīng)病理活檢、血清AFP、影像學(xué)診斷明確為PLC。20名對(duì)照者為鼓樓醫(yī)院體檢健康者，其中男13名；女7名，年齡22－70歲，平均年齡52歲?？崭共杉o脈血2.0ml，以乙二胺四乙酸鉀（EDTA－K2）抗凝。

1.2儀器與試劑流式細(xì)胞儀（BD FACScalibur）；Anti－h(huán)uman CD1d－APC（Clone：51.1）和同型對(duì)照Mouse IgG2b－APC為eBioscience公司產(chǎn)品；CD45－PreCP／CD19－FITC／CD5－PE、同型對(duì)照IgG1－PE和溶血素（FACSLysing Solution）均為BD Biosciences公司產(chǎn)品；鞘液使用Backman－Coulter公司ISOTONⅢ血細(xì)胞稀釋液。

1.3檢測(cè)方法取CD45－PreCP／CD19－FITC／CD5－PE／CD1d－APC單抗各10μl加入流式專用試管底部，以CD45－PreCP／CD19－FITC／CD1d－APC／IgG1－PE各10μl作為CD5－PE同型對(duì)照管、CD45－PreCP／CD19－FITC／IgG－APC／CD5－PE各10μl作為CD1d－APC同型對(duì)照管。每管加入EDTA－K2抗凝全血100μl，旋渦混勻后，置室溫避光反應(yīng)15 min，然后加入溶血素2.0ml，旋渦混勻，室溫避光溶血5min后以1 500r／min離心5min，棄上清液，加入鞘液2.0ml，旋渦混勻后1 500r／min離心5 min，棄上清液，加400μl鞘液，混勻后流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4流式細(xì)胞儀分析在側(cè)向角（SSC）／CD45設(shè)“門”于淋巴細(xì)胞“R1”，將其“Format”至另一散點(diǎn)圖SSC／CD19上設(shè)“門”于B細(xì)胞“R2”。另設(shè)邏輯門G3＝R1and R2，“Format”G3至CD5／CD1d散點(diǎn)圖中，進(jìn)行Breg（CD19＋CD5＋CD1d＋）亞群檢測(cè)。用Cell Quest軟件獲取50000個(gè)以上細(xì)胞數(shù)據(jù)，分析外周血Breg亞群的百分率，結(jié)果以百分比表示。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx± s）表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)組間比較用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用Tamhane’s T2檢驗(yàn)。組間P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Breg亞群使用CD45－Pre－CP／CD19－FITC／CD5－PE／CD1d－APC單克隆抗體免疫標(biāo)記，參照同型對(duì)照結(jié)果，通過流式細(xì)胞術(shù)可以清楚檢測(cè)到Breg（CD19＋CD5＋CD1d＋）亞群表達(dá)比率。結(jié)果見圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)分析調(diào)節(jié)性B細(xì)胞亞群散點(diǎn)圖

2.2LC患者組、PLC患者組與健康對(duì)照組Breg亞群的比較24例LC患者外周血Breg比率（29.90 ±9.19）%和28例PLC患者Breg比率（31.34± 8.99%均顯著高于健康對(duì)照組（22.50±6.52）%，分別為P＝0.016和P＝0.003；肝硬化患者組和肝癌患者組間Breg比率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 調(diào)節(jié)性B細(xì)胞亞群水平比較（ˉx±s）

3 討論

LC和PLC在我國(guó)屬于常見病、多發(fā)病，HBV感染是兩者的主要危險(xiǎn)致病因素。慢性乙肝－肝硬化－肝癌三步曲的發(fā)展轉(zhuǎn)變過程中，相關(guān)的免疫學(xué)機(jī)制復(fù)雜，多數(shù)研究者認(rèn)為與機(jī)體的免疫應(yīng)答及調(diào)控紊亂有密切的關(guān)系。過去許多研究顯示，T淋巴細(xì)胞免疫功能紊亂是疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因，主要表現(xiàn)為患者外周血CD4＋CD8＋細(xì)胞數(shù)及比例紊亂［7］；Th1／Th2平衡調(diào)節(jié)紊亂［7］；Treg和Th17免疫調(diào)節(jié)紊亂［8，9］。B細(xì)胞作為免疫活性細(xì)胞主要的功能是產(chǎn)生特異性抗體，在抗感染免疫過程中發(fā)揮重要作用。隨著研究的不斷深入，B細(xì)胞其它的功能也越來越多的被揭示。B細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用由Wolf等人［10］在研究急性實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）時(shí)提出，隨后Filatreau等［11］發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞在IL－10缺乏的情況對(duì)EAE的發(fā)生有促進(jìn)作用。2006年，Mizoguchi等［12］首先使用調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的概念來定義這群具有負(fù)向調(diào)節(jié)功能的B細(xì)胞群體。2008年，Yanaba等［5］在研究小鼠CHS模型時(shí)首次證實(shí)這種特殊細(xì)胞亞群的存在，以CD19＋CD5＋CD1d＋為表型特點(diǎn)，也是第一種被證實(shí)的Breg亞群。Breg又名B10細(xì)胞，通過分泌白介素IL－10誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th2分化、抑制Th1的分化而影響Th1／Th2的平衡，并且抑制Th17細(xì)胞的誘導(dǎo)和募集Treg、NKT等抑制性細(xì)胞［13－15］，參與介導(dǎo)病毒感染及腫瘤的免疫應(yīng)答。

目前對(duì)于人體Breg表型的研究尚無定論，疾病不同表型不同；同一表型在不同疾病中的作用也不同。Breg可能不僅是某一種特定標(biāo)志的細(xì)胞群，而是多組不同亞群的集合，CD19＋CD5＋CD1d＋亞群是其中主要的代表，我們的實(shí)驗(yàn)僅對(duì)（CD19＋CD5＋CD1d＋）Breg亞群進(jìn)行研究。在對(duì)外周血Breg占B淋巴細(xì)胞的比率分析后我們發(fā)現(xiàn)，LC和PLC患者Breg亞群比率均顯著高于健康對(duì)照組，提示在LC和PLC患者體內(nèi)不僅存在上文所提的T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)紊亂，而且同時(shí)存在B細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)紊亂，并且兩組患者Breg免疫紊亂的傾向是一致的。導(dǎo)致患者Breg比率升高的原因可能有：①患者體內(nèi)B細(xì)胞數(shù)高增殖［2，3］和活化B細(xì)胞高表達(dá)［4］，反饋性的增加和活化Breg數(shù)量；②患者B1（CD5＋B）細(xì)胞顯著增加［5］，B1細(xì)胞分為B1a和B1b，B1a細(xì)胞在自身免疫性等疾病的發(fā)病和進(jìn)展中起重要作用并具有產(chǎn)生IL－10的能力，因此多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Breg源自B1a細(xì)胞［16］；③患者存在的T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)紊亂誘使機(jī)體產(chǎn)生更多的Breg對(duì)抗平衡失調(diào)，影響T細(xì)胞對(duì)病毒感染和腫瘤的攻擊。本次研究沒有發(fā)現(xiàn)LC和PLC患者組間Breg亞群存在顯著性差異，原因可能有：①PLC患者經(jīng)歷過或合并有LC疾病，具有與LC相似的免疫環(huán)境；②研究的樣本量不夠多。③外周血部分Breg募集到癌組織中，導(dǎo)致外周血Breg差異不顯著。

綜上所述，LC和PLC患者外周血Breg亞群均顯著升高，提示Breg與肝硬化、肝癌B細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)紊亂相關(guān)。LC和PLC患者之間Breg亞群比較由于受臨床樣本量的限制，尚需進(jìn)行大樣本的臨床觀察以及對(duì)肝臟局部組織的研究以進(jìn)一步了解Breg在LC和PLC間轉(zhuǎn)化的作用與意義。

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Detection of regulatory B cells among Peripheral blood from patients diagnosed as primary liver cancer and Hepatitis B with Cirrhosis

SUN Jian，CHEN Jun－h(huán)ao，ZHANG Kui，et al.（Department of Laboratory，Gulou Affiliated Hospital of Medical College of Nanjing University，Nanjing210008，China）

ObjectiveTo explore the relationship bewteen regulatory B cells（Breg）with liver cirrhosis and Hepatic carcinomaby analyzing the proportions of Bregs.MethodsTaking CD19＋CD5＋CD1d＋as the marker of the Breg，F(xiàn)low cytometry was implemented to determine the proportions of Bregs among the B lymphocytes from the 24patients with liver cirrhosis，28ones with Hepatic carcinoma and 20Healthy controls.ResultsThe proportions of Bregs among patients with liver cirrhosis and the ones with Hepatic carcinoma were significantly higher than those of the Healthy controls（29.90±9.19%vs 22.50±6.52%，P＝0.016vs P＝0.003），and no significant difference was observed between the proportions among the patients with liver cirrhosis and with Hepatic carcinoma（P＞0.05）.ConclusionThe proportions of Bregs among patients with liver cirrhosis and Hepatic carcinoma were obviously higher than that of healthy controls which indicates that the increase of Bregs may relate to the regulatory disorders of B lymphocytes in the patients with liver cirrhosis and Hepatic carcinoma.

regulatory B cells；Hepatitis B；liver cirrhosis；primary liver cancer；flow cytometry

R735.7

：A

孫?。?969－），男，副主任技師，主要從事臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)及研究工作。

2013－07－17）

1007－4287（2014）12－1975－04

＊通訊作者