王 芳，田宏偉，丁 輝，祁媚嬌

多探針熒光原位雜交技術在膀胱尿路上皮癌診斷中的意義

王 芳1，田宏偉2，丁 輝3，祁媚嬌3

（1.蘭州大學基礎醫(yī)學院；2.甘肅省人民醫(yī)院；3.蘭州大學第二醫(yī)院泌尿外科，甘肅蘭州730000）

目的探討多探針熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）在膀胱尿路上皮癌診斷的可行性，并探討其與腫瘤臨床分期和病理分級的關系。方法收集經(jīng)膀胱鏡檢查診斷為膀胱移行細胞癌35例患者，及10例非腫瘤病人，10例正常人群的新鮮尿液標本，應用FISH檢測膀胱尿路上皮癌患者尿液脫落細胞中的3、7、17、9號染色體異常，并進行尿細胞學檢測（Urinary cytological examination，UCE）。統(tǒng)計學分析FISH和UCE診斷膀胱癌的靈敏性和特異性，并分析FISH檢測染色體突變與膀胱腫瘤分期及分級的相關性。結果多探針聯(lián)合FISH技術與UCE診斷膀胱癌的靈敏度分別為82.86%和37.14%（P＜0.05），特異度分別為95.0%和100%（P＞0.05）。3、7及17號染色體著絲粒特異性探針及9號染色體長臂2區(qū)1帶（9p21）的p16位點特異性探針聯(lián)合應用診斷膀胱癌的靈敏度為82.86%，而單一探針診斷膀胱癌的靈敏度最高僅為65.71%。膀胱癌患者中發(fā)生3、7、17號染色體畸變及9號染色體p16基因畸變均與不同病理分級（G1－G3）有關（P＜0.05）；3、7號染色體畸變與臨床分期（T0－T4）有相關性（P＜0.05），而17號染色體及9號染色體p16基因畸變與臨床分期無相關性（P＞0.05）。結論多熒光探針FISH診斷膀胱尿路上皮癌敏感性高、特異性強、無創(chuàng)，且與腫瘤分期和分級有一定相關性，臨床應用價值高。

膀胱癌；熒光原位雜交技術；染色體變異；尿脫落細胞學；分子細胞遺傳學

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1957）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)較常見的腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。世界范圍內，膀胱癌發(fā)病率居惡性腫瘤的第九位，在男性排名第六位，女性排在第十位左右。尿脫落細胞學和膀胱鏡檢查是當前臨床中診斷膀胱癌最常用的方法，其中尿脫落細胞學（Urinary cytological examination，UCE）檢查特異性較高，且為無創(chuàng)性檢查，但其敏感性較低，尤其對于分期及分級較低的腫瘤。膀胱鏡檢查的優(yōu)點是敏感性較高，但缺點是對尚無突出粘膜表面的早期癌診斷的敏感較低，而且是有創(chuàng)性的。

研究報道在膀胱癌中，一些染色體會發(fā)生非隨機性的改變，包括結構畸變和染色體數(shù)目異常。常見結構畸變的染色體有1、3、5、9、11、17、21，數(shù)目異常的染色體有1、3、7、8、9、10、11、15、17、Y［1］。其中3號染色體的單體性、7號染色體的三體性、17號染色體的多體性、9q21P16基因的雜合性缺失與膀胱癌的發(fā)生及復發(fā)有顯著的關系，而且在膀胱癌中這幾種染色體同時出現(xiàn)異常的比例較高。熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是一種無創(chuàng)的特異性檢測尿脫落細胞中染色體異常的技術，近些年受到了越來越廣泛的關注［2－5］。本研究選用針對3、7、9、17號染色體的特異性探針，對膀胱癌、非膀胱癌患者和正常人尿液的脫落細胞進行FISH檢測，并與尿脫落細胞學檢測結果進行比較，同時結合臨床分期及病理分級，以探討多探針FISH技術在膀胱癌診斷及監(jiān)測中的應用價值。

1 材料與方法

1.1臨床患者資料

收集蘭州大學第二醫(yī)院及甘肅省人民醫(yī)院泌尿外科35例膀胱癌住院患者的新鮮尿液，其中男22例，女13例，年齡26－88歲，中位年齡60歲。所有病例均經(jīng)膀胱鏡檢查診斷為膀胱移行細胞癌。腫瘤的臨床病理情況（膀胱腫瘤2002TNM分期系統(tǒng)和WHO 1973分級法）：T0－T18例，T212例，T310例，T45例；G114例，G210例，G311例。另設對照組20例（包括泌尿系統(tǒng)良性疾病10例，正常人群10例），以建立染色體的畸變閾值并制定陽性判定標準。所有人組的病例均簽署知情同意書，通過倫理委員會批準。

1.2主要儀器和試劑

采用美國UroVysionTM Bladder Cancer Kit（GLP P16／CEPl7／CEP3／CEP7DNA探針），其中CEP3、CEP7、CEP17三個DNA探針分別覆蓋3、7、17號染色體的著絲粒區(qū)域，CLP P16探針覆蓋人類9號染色體長臂2區(qū)1帶（9p21）的P16基因。3號CEP為紅色熒光信號，7號CEP為綠色熒光信號，17號CEP為藍色熒光信號，雜交到9號染色體長臂（9p21）的P16探針為金色熒光信號。主要儀器有熒光顯微鏡（Olympus IX81），電熱恒溫水浴槽、離心機和干燥箱等。RNaseA溶液和胃蛋白酶溶液購自Transgene公司。

1.3標本采集與處理

患者均在膀胱鏡檢查前行尿脫落細胞學檢查和FISH檢測。連續(xù)3d留取患者晨尿200ml，1h內送檢。每份尿樣分為2份，分別進行尿脫落細胞學檢查和FISH檢測，并將其檢測結果與最終的膀胱鏡病理檢查結果比較。將收集到的尿液離心10 min（2 000r／min），棄上清，用37℃水浴預熱的膠原酶B（0.5mg／ml）重懸沉淀，并置于37℃水浴中消化20min，離心棄上清，再用KCl（0.075mol／L）重懸沉淀，置于37℃水浴中20min，再加入2ml固定液顛倒混勻后離心，棄上清，再加入固定液重懸沉淀，于室溫中靜置10min，離心棄上清，重復固定1次，滴片。玻片在56℃老化30min后置入RNA酶溶液（100μg／mL）30min，再放入胃蛋白酶鹽酸溶液中10min，用2×SSC溶液室溫洗滌2次，每次5min，梯度乙醇脫水，準備變性雜交。

1.4原位雜交及信號觀察

將70%甲酰胺與2×SSC溶液混合，置于75℃水浴中預熱，然后將玻片置入該溶液中變性10 min，再立即置入預冷至－20℃的75%乙醇中，用梯度乙醇脫水后，晾干備用。將探針置于75℃水浴中變性7min，再置于48℃中備用。晾干的玻片在48℃中預熱5min，然后將10ml探針混合液滴于原有脫落細胞滴片處，立即加蓋蓋玻片，并用封口膜包被，置于43℃濕盒雜交過夜。拆除封口膜，去掉蓋玻片，用預熱至48℃的50%甲酰胺與2×SSC混合溶液洗滌3次，每次5min，再用2×SSC溶液洗滌10min，用0.1%NP－40細胞裂解液與2×SSC混合溶液洗滌5min，置于暗處晾干后，滴加15μl DAPI熒光染料后封片20min，置于暗處，待觀察。每例分析100個間期細胞核，細胞重疊、破損者不計數(shù)，微弱雜交信號不計數(shù)，細胞內雜交信號間距小于信號點直徑2倍者記為1個信號點。觀察細胞信號點，統(tǒng)計樣本中信號點異常的細胞比例。

1.5尿脫落細胞學檢查

將受檢患者的尿液標本離心后取脫落細胞制成病理涂片，用顯微鏡進行觀察，每例患者連續(xù)留取3 d尿液標本做脫落細胞學檢查，發(fā)現(xiàn)1次癌細胞即可判定為陽性結果。

1.6統(tǒng)計學方法

用SPSS 15.0軟件進行分析統(tǒng)計，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1閾值的建立

20例正常人尿液，采用以上方法步驟制備玻片及進行FISH實驗，進行閾值測定。閾值是指染色體在正常人發(fā)生畸變的最低值，是用于判斷染色體畸變的臨界值，閾值＝異常信號點細胞數(shù)目平均值±3倍標準差。結果見表1。

2.2膀胱癌患者尿液的FISH檢測結果

表1 用20例正常人尿液建立FISH閾值

在正常人和非尿路上皮癌患者中，F(xiàn)ISH結果顯示各探針表現(xiàn)為2紅、2綠、2藍、2金的4色雜交信號（圖1A）。在尿路上皮癌患者中，F(xiàn)ISH結果可見不同程度的染色體數(shù)目異常（圖1B，C，D）。3、7、17號染色體畸變表現(xiàn)為多倍體，如三體、四體或多體；9號染色體畸變表現(xiàn)為缺失、單體或者多體。

圖1 膀胱癌患者尿液的FISH檢測結果。紅色為CEP3，綠色為CEP7，黃色為9號染色體GLP P16探針，藍色為CEP17探針。A，正常。B，C，D均為異常。

2.3尿脫落細胞學和FISH檢測結果的比較

35例膀胱癌患者中，F(xiàn)ISH陽性29例，尿細胞學陽性13例。FISH和尿細胞學診斷膀胱癌的總敏感性分別為82.86%和37.14%。20例非膀胱癌對照組中19例FISH檢測陰性，特異性95%，尿脫落細胞學檢查均為陰性，特異性100%，表2。FISH檢測診斷膀胱癌的靈敏度明顯高于尿脫落細胞學檢查（P＜0.01），而兩者特異度相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.4多探針FISH和單一探針FISH檢測結果比較

為了比較多探針FISH和單一探針FISH檢測膀胱癌的靈敏度，我們分別用聯(lián)合探針和四種單一的探針進行了實驗。結果表明膀胱癌患者中發(fā)生3、7、9號染色體P16基因及17號染色體的畸變率分別為62.86%、51.43%、54.29%和65.71%，均明顯低于聯(lián)合法檢測的陽性率（82.86%）（表3），說明四種探針聯(lián)合應用可明顯提高膀胱癌的檢出率。

表2 尿脫落細胞學和FISH檢測診斷膀胱癌的比較

表3 FISH結果與膀胱癌病理分級、臨床分期的關系

2.5FISH結果與膀胱癌病例分級、分期的關系

為了研究膀胱癌患者尿脫落細胞間期核3、7、9、17號染色體的畸變率是否與不同病理分級（G1－G3）及臨床分期（T0－T4）有關，我們分別用聯(lián)合探針及四種探針單獨檢測了不同病理分級及臨床分期膀胱癌患者的染色體畸變率。四種探針聯(lián)合FISH的靈敏度在膀胱癌病理分級G1、G2、G3分別為42.86%，80%，100%，在臨床分期T0－T1，T2－T4分別為62.50%、88.89%，且病理分級和臨床分期越高，染色體畸變的陽性率越高（表3）。我們將三個不同病理分級（G1，G2，G3）的CEP3檢測的陽性率進行比較，用SPSS15.0進行卡方檢驗，得卡方值為8.344，P＝0.015，P＜0.05，故認為三個病理分級的CEP3陽性率的差別有統(tǒng)計學意義，說明3號染色體的畸變與膀胱癌的不同病理分級（G1－G3）有關，且病理分級越高，3號染色體畸變的陽性率越高（表3）。用同樣的方法，將三個不同病理分級（G1，G2，G3）的CEP7、GLP P16及CEP17檢測的陽性率進行比較，結果表明卡方值分別為9.405，6.233及11.413，P值均小于0.05（表3），說明3、7、17號染色體畸變及9號染色體p16基因畸變率均與膀胱癌的不同病理分級（G1－G3）有關（P＜0.05）。

另外，我們還將不同臨床分期（T0－T1，T2－T4）分別與四種探針的陽性率比較，進行卡方檢驗，結果表明3、7號染色體畸變與臨床分期有相關性（P＜0.05），而17號染色體及9號染色體p16基因畸變與臨床分期無相關性（P＞0.05），見表3。

3 討論

熒光原位雜交技術作為一項常用的細胞遺傳學檢測技術，主要用于染色體數(shù)目和結構畸變的研究。細胞遺傳學的大量研究表明，膀胱癌在其發(fā)生發(fā)展過程中表現(xiàn)為某些染色體的畸變。近年來，膀胱癌的FISH檢測及其臨床應用成為研究熱點［6］。

本研究采用針對3、7、9、17號染色體的FISH探針，檢測并分析膀胱癌的染色體畸變，以探討FISH在國內膀胱癌的臨床應用價值。在本研究中，多探針聯(lián)合FISH診斷與尿脫落細胞學診斷方法的靈敏度分別為82.86%和37.14%（P＜0.05），特異度分別為95.0%和100%（P＞0.05）。另外，多探針聯(lián)合FISH的靈敏度在膀胱癌病理分級G1、G2、G3分別為42.86%，80%，100%，在臨床分期T0－T1，T2－T4分別為62.50%、88.89%，四種染色體聯(lián)合畸變程度與腫瘤的病理分級（G1－G3）有相關性（P＝0.006），與文獻報告結果［7］相符。

3號染色體的異常在膀胱癌較為常見，約占47.4%，與腫瘤的分級有一定相關性，且常與其他染色體的異常并存，因此可作為腫瘤浸潤性的預測指標［8］。7號染色體的畸變在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，其多倍性的發(fā)生率大約為13.0%－76.2%，且其多倍體的倍數(shù)與膀胱腫瘤的病理分期、臨床分級密切相關，在復發(fā)性和浸潤性膀胱癌中該染色體的三倍體發(fā)生率較高［9］。另外，有研究報道17號染色體的異倍體是膀胱癌進展和侵襲的標志之一，且其異倍體與腫瘤的分期、分級密切相關［10］。在膀胱腫瘤中較常見的染色體變化還有9號染色體的部分或全部丟失，且其與腫瘤的早期發(fā)生密切相關，國外研究報道膀胱癌患者9號染色體長臂2區(qū)1帶的純合性缺失率高達83%［11－12］。在本研究中，膀胱癌患者中發(fā)生3、7、9號染色體P16基因及17號染色體的畸變率分別為62.86%、51.43%、54.29%和65.71%，并發(fā)現(xiàn)與病理分級（G1－G3）有明顯相關（P＜0.05）；9號染色體P16基因突變中10例（10／19）表現(xiàn)為不全缺失或完全缺失，有9例（9／19）表現(xiàn)為多倍體；3、7號染色體畸變與臨床分期（T0－T4）有相關性（P＜0.05），而17號染色體及9號染色體p16基因畸變與臨床分期無相關性（P＞0.05），這一結果或許與樣本量有關。

3、7及17號染色體著絲粒特異性探針及9號染色體p16位點特異性探針聯(lián)合應用診斷膀胱癌的靈敏度為82.86%，而單一探針診斷膀胱癌的靈敏度最高僅為65.71%，故四種探針聯(lián)合應用可明顯提高膀胱癌的檢出率。

綜上所述，使用FISH技術檢測患者尿液中3、7、9、17號染色體畸變來診斷膀胱癌，具有無創(chuàng)且敏感度高、特異性強的優(yōu)點，對尿路上皮癌患者有輔助診斷作用，具有一定的臨床應用價值。

［1］曾銘強，蔣雷鳴，肖勝軍，等.多色熒光原位雜交在膀胱癌診斷及檢測中的意義［J］.臨床泌尿外科雜志，2010，25（4）：245.

［2］Fernández MI，Parikh S，Grossman HB，et al.The role of FISH and cytology in upper urinary tract surveillance after radical cystectomy for bladder cancer［J］.Urol Oncol，2012，30（6）：821.

［3］馬春雷，李錦毅，王運平.膀胱癌染色體畸變的FISH檢測及其應用進展［J］.中國實驗診斷學，2009，13（5）：697.

［4］Youssef RF，Schlomer BJ，Ho R，et al.Role of fluorescence in situ hybridization in bladder cancer surveillance of patients with negative cytology［J］.Urologic oncology，2010，30（3）：273.

［5］Schlomer BJ，Ho R，Sagalowsky A，et al.Prospective validation ofthe clinical usefulness of reflex fluorescence in situ hybridization assay in patients with atypical cytology for the detection of urothelial carcinoma of the bladder［J］.Journal of Urology，2010，183（1）：62.

［6］Karnwal A，Venegas R，Shuch B，et al.The role of fluorescence in situ hybridization assay for surveillance of non－muscle invasive bladder cancer［J］.The Canadian Journal of Urology，2010，17（2）：5077.

［7］馬春雷，司 今，戴 聰，等.膀胱癌熒光原位雜交檢測及其臨床意義［J］.中國腫瘤臨床，2009，36（23）：1329.

［8］Matteo Puntoni，Silvia Zanardi，Daniela Branchi，et al.Prognostic Effect of DNA Aneuploidy from BladderWashings in Superficial Bladder Cancer［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2009，16（5）：979.

［9］Kevin C.Halling MD，PhD，Benjamin R.KippMS，MP，CT（ASCP）.Fluorescence in situ hybridization in diagnosticcytology［J］.Human Pathology，2009，38（8）：1137.

［10］Mercedes Marin－Aguilera，Lourdes Mengual，Maria Jose Ribal，et al.Utility of Fluorescence In Situ Hybridization as a Non－invasive Technique in the Diagnosis of Upper Urinary Tract Urothelial Carcinoma［J］.European Urology，2009，51（1）：409.

［11］Tine Hajdinjak，MD.UroVysion FISH test fordetecting urothelial cancers：Meta－analysis of diagnostic accuracy and comparison with urinary cytology testing［J］.Urologic Oncology：Seminars and Original Investigations，2008，26（6）：646.

［12］Benjamin R.Kipp，Kevin C.Halling，Michael B.Campion，et al.Assessing the Value of Reflex Fluorescence In Situ Hybridization Testing in the Diagnosis of Bladder Cancer When Routine Urine Cytological Examination is Equivocal［J］.The Journal of Urology，2008，179（4）：1296.

The Significance of Multiprobe Fluorescence in Situ Hybridization in Diagnosis of Urary Bladder Cancer

WANG Fang1，TIAN Hong－wei2，DING Hui3，et al.（1.School of Basic Medicine in Lanzhou University；2.Gansu Provincial Hospital；3.Department of Urology in the Second Hospital of Lanzhou University，Lanzhou730000，China）

ObjectiveTo evaluate the fasibility of multiprobe fluorescence in situ hybridization（FISH）assay in diagnosing urine bladder cancer，and to discuss the relationship of FISH and clinical stages and pathological grades.MethodsFresh urinary specimen was recruited from 35bladder cancer patients who were diagnosed by biopsies，10non－tumor patients，and 10healthy individuals.Exfoliated cells from fresh urinary specimen was collected and analyzed by FISH using centromeric probes of chromosome 3，7，17and region probe of 9p21.Urinary cytological examination（UCE）was applied at the same time.The sensitivity and specificity of each method in the diagnosis of bladder cancer were determined and various chromosomal aberrations and malignant degree of correlation by comparative analysis.ResultsThe sensitivity of mutiprobe FISH and UCE in diagnosing bladder cancer were 82.86%and 37.14%respectively（P＜0.05），the specificity of mutiprobe FISH and UCE were 95.0%and 100%respectively（P＞0.05）.The sensitivity of combine centromeric probes of chromosome 3，7，17and region probe of 9p21together was 82.86%，while the highest sensitivity using one of them was just 65.71%.The aberration frequency of chromosomes 3，7，17and 9p21were positively associated with the pathological grades（G1－G3）（P＜0.05）.Meanwhile，the abnormality of chromosomes 3and 7 were positively associated with clinical stages（T0－T4）（P＜0.05），however，the aberration frequency of chromosomes 17and 9p21were proved not to be correlated with clinical stages of bladder cancer（P＞0.05）.ConclusionMutiprobe FISH has high value for diagnosing bladder cancer because of its high sensitivity，accurate，non－invasive，and relationship with clinical stages and pathological grades.

Bladder cancer；Fluorescence in situ hybridization；Chromosome aberration；Urinary cytological examination；Molecular cell genetics

R737.14

：A

王芳（1982－），女，博士，實驗師，主要從事細胞分子醫(yī)學方面的研究。

2013－09－14）

1007－4287（2014）12－1957－05

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金自由探索項目（lzujbky－2012－148）；蘭州大學實驗技術創(chuàng)新基金項目