周傳兵，徐澤平，劉結(jié)磊，韓曉陽，馮文娟

（山東京博控股股份有限公司，山東濱州256500）

酵母多糖提取原料為啤酒廢酵母或面包酵母，目前全世界的酵母產(chǎn)量超過250萬t，很多酵母除了用于發(fā)酵面包等還用于提取酵母抽提物，剩下的酵母細(xì)胞壁一般作為飼料用，經(jīng)濟(jì)附加值較低[1]。酵母多糖是酵母細(xì)胞壁的重要組成部分，其主要成分為大分子及糖蛋白復(fù)合物，酵母多糖占酵母細(xì)胞壁干重的40%左右，酵母多糖的開發(fā)可大大提高啤酒廢酵母的產(chǎn)品附加值[2]。1961年，由Riggi確定了酵母多糖中具有生物活性的物質(zhì)是葡聚糖,該發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了葡聚糖作為免疫活性物質(zhì)研究的新紀(jì)元[3]。酵母β-葡聚糖是一種活性強(qiáng)、無毒副作用的高效生物應(yīng)答物，具有抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗菌抗病毒等功能，已廣泛用于醫(yī)藥、食品行業(yè)[4]。酵母細(xì)胞壁甘露聚糖能夠提高動(dòng)物免疫力和調(diào)節(jié)腸道菌群平衡并具有抗輻射、抗氧化等活性功能[5-6]。本實(shí)驗(yàn)采用堿法提取，通過微濾和超濾膜、大孔樹脂吸附等分離純化技術(shù)得到堿提多糖和酵母葡聚糖。并對提取原料和所得樣品進(jìn)行了脂質(zhì)、蛋白、總糖含量的分析，采用HPLC對兩種多糖的單糖組成進(jìn)行了分析。為酵母多糖的提取、純化、成分分析及應(yīng)用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

啤酒酵母粉：唐山拓?fù)渖锟萍加邢薰?；單糖?biāo)品：葡萄糖、甘露糖（sigma）三氟乙酸、氫氧化鈉、正己烷等均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

陶瓷微濾膜設(shè)備、超濾膜設(shè)備：合肥世杰膜設(shè)備有限公司；UV-1700紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；高效液相色譜：SHIMADZU；蒸發(fā)光檢測器；色譜柱為suagr pak-1（waters公司）；小型噴霧干燥設(shè)備：山東奧諾能源科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母多糖的提取、分離、純化

稱取一定量的啤酒酵母粉，加入10倍重量的1 mol/L氫氧化鈉溶液，80℃，攪拌提取2 h，離心，上清液用冰乙酸中和后利用0.2 μm陶瓷膜微濾設(shè)備去除一些膠質(zhì)及細(xì)小不溶物，然后用截留分子量10 000 u的有機(jī)超濾膜設(shè)備對微濾透析液進(jìn)行濃縮、脫鹽，然后利用大孔吸附樹脂對濃縮液進(jìn)行脫蛋白、脫色，超濾濃縮液噴霧干燥得酵母堿提多糖。離心沉淀水洗兩次，離心，沉淀加10倍水，然后用乙酸調(diào)pH至3.0，加熱至60℃，攪拌1 h，離心，蒸餾水洗滌沉淀2次后噴霧干燥得酵母葡聚糖。

1.3.2 脂肪含量測定

取酵母粉和堿提多糖及酵母葡聚糖各10 g，加入160 mL正己烷和40 mL甲醇混勻，加熱回流抽提2 h，冷卻至40℃，然后將混合物過濾，并分別用正己烷、甲醇、乙醚洗滌濾渣，將濾液蒸干得油狀物，稱重。

1.3.3 蛋白含量測定

蛋白質(zhì)檢測采用凱氏定氮法[7]。

1.3.4 總糖含量測定

采用苯酚硫酸法[8]。

1.3.5 HPLC分析單糖組成

1.3.5.1 酵母多糖的水解

分別稱取堿提酵母多糖和不溶葡聚糖兩種酵母多糖0.5 g，加2 mol/L三氟乙酸5 mL，安瓿瓶內(nèi)封管水解，水解溫度110℃，水解時(shí)間6 h。然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除三氟乙酸，加乙醇多次將三氟乙酸帶出。少量水洗出后凍干，備用。

1.3.5.2 色譜條件

色譜柱：waters sugar－pak1，蒸發(fā)光檢測器，柱溫80℃，流動(dòng)相純水，流速0.6 mL/min。

1.3.5.3 實(shí)驗(yàn)方法

標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液及酵母多糖水解樣品溶液，用0.45μm微孔濾膜濾過，吸取15 μL用于液相分析。對比酵母多糖水解液和單糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，確定單糖種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖提取收率及組成成分

噴霧干燥所得堿提多糖為白色粉末，酵母葡聚糖為淡黃色粉末，收率和總糖、蛋白及脂肪的含量見表1。

表1 原料和多糖成分及多糖收率Table 1 The composition of raw material and polysaccharides%

噴霧干燥后堿提多糖和葡聚糖的總糖含量分別為84.39%和92.46%，總糖含量較高。提取所得兩種多糖蛋白含量分別為2.17%和1.66%，與酵母粉相比蛋白含量大幅降低。兩種多糖的脂肪含量也有所降低，因此采用膜分離結(jié)合大孔吸附樹脂對多糖分離純化可以獲得較高純度的多糖。

2.2 HPLC分析結(jié)果

HPLC分析結(jié)果見圖1～圖4。

圖1 甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品HPLCFig.1 HPLC chromatogram of mannose standard

圖2 葡萄糖標(biāo)品HPLCFig.2 HPLC chromatogram of glucose standard

圖3 酵母葡聚糖水解液HPLCFig.3 HPLC chromatogram of hydrolysis glucan liquid

圖4 堿提多糖水解液HPLCFig.4 HPLC chromatogram of hydrolysis alkali soluble polysaccharide liquid

根據(jù)多糖水解液色譜峰和標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間可知（見圖1～3），酵母堿提多糖水解液保留時(shí)間8.841 min的色譜峰為甘露糖，7.848 min的峰為葡萄糖峰，3.909 min的色譜峰為未完全水解的多糖。酵母葡聚糖水解液保留時(shí)間7.833 min的色譜峰為葡萄糖，3.851 min的色譜峰為未完全水解的多糖。由此可知酵母堿提多糖成分為甘露聚糖，含有的及少量的葡萄糖可能是提取過程水解的葡聚糖。酵母葡聚糖成分較純，甘露聚糖已經(jīng)除盡。

3 結(jié)論

1）采用堿提取以及微濾、超濾、大孔樹脂吸附等純化工藝可以得到純度較高的甘露聚糖和酵母葡聚糖。酵母葡聚糖中不含甘露聚糖和其他雜糖，葡聚糖糖含量為92.46%，蛋白含量為1.66%。試驗(yàn)中采用的膜分離和大孔吸附樹脂對多糖進(jìn)行分離純化，噴霧干燥設(shè)備干燥的工藝過程中無有機(jī)溶劑的使用，操作簡單，適合規(guī)?；a(chǎn)。

2）本研究采用HPLC分析單糖組成，使用sugarpak1色譜柱、蒸發(fā)光檢測器得到了很好地分離和檢測結(jié)果。因此該方法可以作為酵母多糖單糖組成的分析方法，彌補(bǔ)了苯酚硫酸法測定總糖而無法分析單糖組成的不足。

[1] Stefan Freimund,Martin Sautera,Othmar K?ppelib，et al.A new nondegrading isolation process for 1,3－β－ －glucan of high purity from baker's yeast Saccharomyces cerevisiae[J].Carbohydrate Polymers,2003,54(2):159－171

[2] 黃國榮,朱俊東,糜漫天,等.啤酒酵母多糖提取工藝的研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,28(6):2

[3] 劉成梅,熊慧微,劉偉,等.Beta－葡聚糖的研究現(xiàn)狀[J].食品研究與開發(fā),2006,27(1):161－163

[4] Vesna ZECHNER－KRPA,Vlatka PETRAVI －TOMINAC,PANJKOTA－KRBAV I.Potential application of yeast β－Glucans in food industry[J].Agriculturae Conspectus Scientificus,2009,74(4):277－282

[5] 高啟禹,徐光翠,李延蘭.甘露寡糖對動(dòng)物腸道菌群及免疫功能的研究[J].飼料研究,2010(2):19－20

[6] Pontón J,Omaetxebarría M J,Elguezabal N,et al.Immunoreactivity of the fungal cell wall[J].Medical Mycology,2001,39(1):101－110

[7] T Ma,G Zuazaga.Micro－Kjeldahl.Determination of nitrogen：a new indicator and an improved rapid method[J].Industrial&Engineering Chemistry.Analytical Addition,1942,14(3):280－282

[8]張維杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M].杭州:浙江大學(xué)出版社,1994:37－39