郭豫梅

（陜西理工學(xué)院化工學(xué)院，陜西漢中723001）

雞油菌別名黃絲菌、杏菌，是一種外生菌根真菌，屬真菌界、擔(dān)子菌門、同擔(dān)子菌綱、雞油菌目、雞油菌科和雞油菌屬[1]。其實(shí)體肉質(zhì)，全菌杏黃色、蛋黃色或枇杷黃色，有濃郁的杏仁果香味，微甜，肉質(zhì)內(nèi)實(shí)。多見于夏秋季，常生于排水良好的緩坡上的針闊葉林地上，如松樹下腐爛的松毛下面或麻櫟下的草叢里，群生或近叢生。在我國(guó)主要分布于貴州、云南、黑龍江、江蘇、青海、四川、西藏等地[2]。研究表明，該菌性平，味甘，有清目利肺、益腸胃之功效，經(jīng)常食用可治療VA缺乏所引氣的皮膚粗糙或干燥癥、夜盲癥、視力失常、眼炎等疾病以及預(yù)防某些呼吸道感染的疾病。據(jù)報(bào)道，該菌試驗(yàn)有抗癌作用，對(duì)小白鼠肉瘤180抑制率為60%，對(duì)艾氏癌的抑制為70%，另有抑制和抗某些細(xì)菌的作用[3]。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，黃酮類化合物對(duì)心血管、腦血管、腫瘤等方面均有顯著的藥理作用，說(shuō)明此類化合物確有多種生物活性[4]。該類化合物種類繁多，存在植物體中含有多重藥理作用，如黃蜀葵花總黃酮可以保護(hù)心肌受損、抗心絞痛、保護(hù)缺血性腦損傷；銀杏黃酮?jiǎng)t具有鎮(zhèn)痛、降血壓、抗凝血、保護(hù)腦血管等作用。故其作為新藥研究開發(fā)的先導(dǎo)化合物，是一個(gè)值得重視的資源，具有重要的現(xiàn)實(shí)應(yīng)用意義[5-6]。但有關(guān)雞油菌黃酮類化合物抗氧化活性方面的研究還未見報(bào)導(dǎo)，本文采用醇浸提取雞油菌中總黃酮類化合物，并主要研究其抗氧化活性。所得結(jié)果可為雞油菌在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料

雞油菌：購(gòu)于陜西漢中。

1.1.2 試劑

蘆丁：中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度≥99%；乙醇、亞硝酸鈉溶液、氫氧化鈉、硝酸鋁溶液、鄰苯三酚、抗壞血酸（VC）、鄰二氮菲、對(duì)氨基苯磺酸溶液、鹽酸萘已二胺溶液均為分析純。

1.1.3 儀器

GR-200電子分析天平：日本AND；722型可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 方法

取雞油菌樣品在干燥箱中70℃干燥，粉碎，過(guò)100目篩。用天平精確稱取15.000 0 g的樣品，放入燒杯中，加入200 mL 85%的乙醇溶液，在70℃下浸提20 h。抽濾，得總黃酮提取液[7]。

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取蘆丁樣品5.000 0 mg，置50 mL容量瓶中,用30%乙醇適量置水浴上加熱溶解，放冷，再用30%乙醇稀釋至刻度,搖勻。量取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 分別置于10 mL容量瓶中，各加30%乙醇至5.0 mL，然后加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL搖勻，放置6 min，10%硝酸鋁溶液1.0 mL搖勻，放置6 min，再加4%氫氧化鈉溶液10.0 mL，用30%乙醇稀釋至25 mL，放置15 min后，置比色皿中，以試劑同法操作作為空白，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度（A）為橫坐標(biāo)，濃度（C）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1），得到回歸方程為：C=0.091 2A+0.026 3（R=0.999 7）。

圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.2.2 含量的測(cè)定

分別精確量取待測(cè)液0.1 mL，加入9.9 mL的30%乙醇，置于25mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1.0mL搖勻，放置6 min，10%硝酸鋁溶液1.0 mL搖勻，放置6 min，再加4%氫氧化鈉溶液10.0 mL，用30%乙醇稀釋至25 mL，放置15 min后，置比色皿中，以試劑同法操作作為空白，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。通過(guò)回歸方程計(jì)算出溶液濃度（C）（單位g/L）。再運(yùn)用計(jì)算公式：T=C（g/mL）×10×N×50 mL/5 000 mg。得到樣品中總黃酮百分含量（T）[8]。

1.2.3 抗氧化性的測(cè)定

1.2.3.1 雞油菌黃酮類化合物對(duì)超氧自由基（O2·-）的清除作用

采用鄰苯三酚自氧化法[9]。取0.05 mol/L，pH8.2的Tris-HCl緩沖液4.5 mL加入盛有4.2 mL蒸餾水的試管中，置25℃水浴中預(yù)熱20 min。分別加入不同的試樣醇提物溶液0.1 mL，立即加入在25℃水浴中預(yù)熱的3 mmol/L鄰苯三酚（由10 mmol/L HCl配制）0.3 mL，混勻后25℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)4 min，立即加入8 mol/L HCl 2滴終止反應(yīng)，在420 nm處測(cè)定吸光度（樣品管以同濃度的試樣醇提物溶液做參比）。模型組以0.1 mL蒸餾水代替樣品試液（以蒸餾水做參比）。用抗壞血酸（VC）做對(duì)照，分別測(cè)定五組不同濃度的的樣品液及抗壞血酸的吸光度。臨用前以濃度為50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）配置。超氧自由基（O2·-）按以下公式計(jì)算清除率。

1.2.3.2 雞油菌黃酮類化合物對(duì)羥基自由基（·OH）的清除作用

用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測(cè)定Fe2+/H2O2體系中產(chǎn)生的·OH自由基[10]。依次加入鄰二氮菲1.5 mL，pH7.4的PBS溶液3.8 mL及試樣總黃酮溶液1 mL（損傷管及未損傷管不加試樣總黃酮溶液）混勻，再加FeSO4溶液1.5 mL，立即混勻，最后加H2O21 mL（未損傷管不加）。最終濃度鄰二氮菲0.75mmol/L、FeSO40.75mmol/L、H2O20.01%,總體積9 mL（不足用蒸餾水補(bǔ)足）。各管置37℃恒溫水浴箱保溫60 min，分別測(cè)定各管A536值（樣品管以同濃度的試樣總黃酮溶液做參比，損傷管及未損傷管以蒸餾水做參比）。用抗壞血酸（VC）做對(duì)照，分別測(cè)定五組不同濃度的樣品液及抗壞血酸的吸光度。臨用前以蒸餾水配置。（·OH）自由基按以下公式計(jì)算清除率。

1.2.3.3 雞油菌黃酮類化合物對(duì)亞硝酸鹽清除率的測(cè)定

取已知濃度的提取液2 mL于25 mL容量瓶，加入5 μg/mL的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液3 mL，加入檸檬酸－磷酸緩沖溶液（pH＝3.0）5 mL，37℃下反應(yīng) 15 min，立即加入2 mL 0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3 min～5 min后，加入1 mL 0.2%鹽酸萘已二胺溶液，加蒸餾水至刻度，混勻，靜置15 min，以5 mL提取液為空白，在540 nm處測(cè)吸光度。用用抗壞血酸（VC）做對(duì)照，分別測(cè)定五組不同濃度的的樣品液及抗壞血酸的吸光度[11-12]。按下式計(jì)算NO2－的清除率。

式中：A0為NO2－的溶液吸光度；A為樣品組的吸光度。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 總黃酮含量的測(cè)定

根據(jù)1.2.2可得出雞油菌中總黃酮含量為0.68%，從而可得提取液中黃酮含量為0.204 1 g/L。

2.2 抗氧化性的研究

2.2.1 對(duì)超氧自由基（O2·-）的清除作用

根據(jù)方法1.2.3.1，配制五種不同濃度的樣品溶液，測(cè)定其吸光度，并計(jì)算其對(duì)O2·-的清除率，以抗壞血酸為對(duì)照，同法測(cè)定其吸光度，并計(jì)算其對(duì)O2·-的清除率，見圖2和圖3。

2.2.2 對(duì)羥基自由基（·OH）的清除作用

圖2 總黃酮對(duì)超氧自由基的清除率Fig.2 O2-·radical scavenging rate of total flavonoids

圖3 抗壞血酸對(duì)超氧自由基的清除率Fig.3 O2·-radical scavenging rate of VC

根據(jù)方法1.2.3.2，配制5種不同濃度的樣品溶液，測(cè)定其吸光度，并計(jì)算其對(duì)·OH的清除率，以抗壞血酸為對(duì)照，同法測(cè)定其吸光度，并計(jì)算其對(duì)·OH的清除率，見圖4和圖5。

圖4 總黃酮對(duì)羥自由基的清除率Fig.4 ·OH radical scavenging rate of total flavonoids

2.2.3 對(duì)亞硝酸鹽（NO2-）清除率的測(cè)定

根據(jù)方法1.2.3.3，配制5種不同濃度的樣品溶液，測(cè)定其吸光度，并計(jì)算其對(duì)NO2-的清除率，以抗壞血酸為對(duì)照，同法測(cè)定其吸光度，并計(jì)算其對(duì)NO2-的清除率，見圖6和圖7。

由以上各圖可得當(dāng)總黃酮濃度為0.204 1 mg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子的清除率為44.2%，羥基自由基的清除率為11.4%，亞硝酸根的清除率為50%。

圖5 抗壞血酸對(duì)羥自由基的清除率Fig.5 ·OH radical scavenging rate of VC

圖6 總黃酮對(duì)亞硝酸鹽的清除率Fig.6 NO2-scavenging rate of total flavonoids

圖7 抗壞血酸對(duì)亞硝酸鹽的清除率Fig.7 NO2-scavenging rate of VC

3 結(jié)論

由實(shí)驗(yàn)可得當(dāng)總黃酮濃度為0.204 1 g/L時(shí)，對(duì)超氧陰離子的清除率為44.2%，羥基自由基的清除率為11.4%，亞硝酸根的清除率為50%。雞油菌總黃酮能有效的清除超氧自由基（O2·-）、羥基自由基（·OH）及亞硝酸鹽（NO2-）。其質(zhì)量濃度與對(duì)超氧自由基（O2·-）、羥基自由基（·OH）及亞硝酸鹽（NO2-）的清除作用成正相關(guān)系，雖然其清除率小于VC對(duì)超氧自由基、羥基自由基（·OH）及亞硝酸鹽（NO2-）的清除作用但通過(guò)對(duì)雞油菌黃酮清除自由基能力的測(cè)定，確定其具有較強(qiáng)的清除超氧自由基（O2·-）、羥基自由基（·OH）及亞硝酸鹽（NO2-）的能力，從而確定了雞油菌黃酮具有抗氧化能力，可將其作為抗氧化劑應(yīng)用到食品和藥品行業(yè)中，這也將為進(jìn)一步的促進(jìn)天然抗氧化劑的研究與開發(fā)起到一定的積極作用。

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