郭曉強(qiáng)

講師，中國人民解放軍白求恩軍醫(yī)學(xué)院生化教研室，石家莊 050081

酶的研究與生命科學(xué)(一)：酶本質(zhì)的理解和認(rèn)識

郭曉強(qiáng)

講師，中國人民解放軍白求恩軍醫(yī)學(xué)院生化教研室，石家莊 050081

酶；諾貝爾獎；輔酶；蛋白質(zhì)；催化性RNA；核糖核酸酶

酶是生物催化劑，通過催化化學(xué)反應(yīng)而參與了幾乎所有生命過程，因此對酶的研究既深化了對生命現(xiàn)象的理解和認(rèn)識，又為相關(guān)疾病治療提供了新方案。1897年無細(xì)胞酵母發(fā)酵的發(fā)現(xiàn)啟動了現(xiàn)代酶學(xué)研究的序幕，隨后幾十年先后分離并合成輔酶，證明酶的本質(zhì)為蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了具有催化功能RNA等，此外，通過解析核糖核酸酶結(jié)構(gòu)而闡明一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)以及結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)聯(lián)等，這些成果極大地拓展了人們對酶本質(zhì)的理解和認(rèn)識，做出卓越貢獻(xiàn)的科學(xué)家也因此榮獲諾貝爾獎。

蛋白質(zhì)、核酸和糖等生物大分子和維生素、無機(jī)離子等小分子構(gòu)成了生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，這些分子通過特定化學(xué)反應(yīng)而實現(xiàn)生命基本過程，包括新陳代謝、生殖等。生命處于一個相對溫和的環(huán)境，而許多化學(xué)反應(yīng)又往往需要一個劇烈條件，為此就需要催化劑協(xié)助完成。酶(enzyme)就是生物體內(nèi)的催化劑，通過有效降低反應(yīng)活化能而加快反應(yīng)速度。酶通過自身高效、專一和可調(diào)等特性有效保證生命的高度有序性和高度適應(yīng)性，因此，酶構(gòu)成了生命基礎(chǔ)，它催化的各種生化反應(yīng)保證了能量生成、物質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞增殖和物種繁殖等過程的正常進(jìn)行。

人和哺乳動物體內(nèi)有幾千種酶，它們分布于血漿或細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)可定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞核以及細(xì)胞器等位置。酶缺乏或功能異常可造成多種疾病發(fā)生，因此通過補(bǔ)充酶或酶活性調(diào)節(jié)分子可實現(xiàn)疾病治療的目的，如通過補(bǔ)充胃蛋白酶可幫助消化等。

酶的重要性在生命科學(xué)發(fā)展過程中也得到了全面體現(xiàn)，相關(guān)進(jìn)展一方面拓展了對生命過程的理解和認(rèn)識，另一方面也對疾病診斷、預(yù)防和治療的改進(jìn)發(fā)揮了極大推動作用。酶的重要性也得到了諾貝爾獎的高度青睞，至今有二十余項獲獎成果與酶的特性、新酶鑒定及酶的應(yīng)用等密切相關(guān)。本文旨在通過對相關(guān)成果的介紹展現(xiàn)酶的重要性。

1 無細(xì)胞發(fā)酵的發(fā)現(xiàn)

雖然酶的應(yīng)用具有悠久歷史，如中國2 000年前就懂得釀酒，但真正意義上對酶的研究從19世紀(jì)開始。1833年，法國化學(xué)家佩恩(Anselme Payen)發(fā)現(xiàn)第一個酶——淀粉酶，隨后多種蛋白酶亦被鑒定成功。1877年，德國生理學(xué)家屈內(nèi)(Wilhelm Friedrich Kühne)首次將這類具有催化功能的物質(zhì)命名為酶。另外，法國微生物學(xué)家巴斯德(Louis Pasteur)在研究酵母發(fā)酵的過程中發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下酵母具有將蔗糖轉(zhuǎn)化為酒精和二氧化碳的能力，將酵母內(nèi)具有這種催化能力的物質(zhì)稱為酵素(ferment)。但巴斯德在隨后研究中發(fā)現(xiàn)，酵母碾碎后喪失了催化能力，因此提出酵素只有在活細(xì)胞內(nèi)才可發(fā)揮生物學(xué)作用。這個觀點還被進(jìn)一步擴(kuò)展，認(rèn)為代謝過程是生命特有現(xiàn)象，只有在活細(xì)胞內(nèi)完成，而在體外無法實現(xiàn)，這就是活力論。因此，當(dāng)時就存在兩類“酶”，即體外發(fā)揮作用的“enzyme”和體內(nèi)發(fā)揮作用的“ferments”。1897年，德國化學(xué)家畢希納 (Eduard Buchner)的無細(xì)胞發(fā)酵現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)則實現(xiàn)了兩類“酶”的統(tǒng)一，推動了酶學(xué)的快速發(fā)展。

畢希納在哥哥資助下進(jìn)入慕尼黑大學(xué)跟隨著名化學(xué)家拜爾(Adolf von Baeyer，1905年諾貝爾化學(xué)獎獲得者)學(xué)習(xí)，一方面掌握了化學(xué)相關(guān)知識，另一方面還開始研究酵母發(fā)酵，其目的并非發(fā)酵和酶，而是想探索酵母汁的醫(yī)學(xué)價值。

畢希納和助手漢恩(Martin Hahn)首先用沙子和硅藻土研磨酵母破壞外壁，隨后將得到的混合物應(yīng)用過濾法除去未粉碎酵母及酵母碎片，從而獲得較純凈酵母汁。畢希納采用物理法較傳統(tǒng)方法(特殊溶劑或高壓)破壞性小，可最大程度保持酵母汁內(nèi)物質(zhì)的活性。畢希納可一次獲得大量酵母汁，為了防腐將蔗糖放入其中，結(jié)果卻總是會有氣泡產(chǎn)生，進(jìn)一步分析表明氣泡是由于產(chǎn)生了二氧化碳；因此，畢希納發(fā)現(xiàn)了單獨酵母汁也具有催化蔗糖發(fā)酵的能力(圖1)。這意味著酵素的作用不再需要活酵母的存在，在體外也具有活性[1]。畢希納進(jìn)一步將能催化糖分解為酒精和二氧化碳的物質(zhì)稱為釀酶(zymase)，從而實現(xiàn)兩類酶的統(tǒng)一。

圖1 畢希納和無細(xì)胞發(fā)酵

1907年，畢希納由于“生物化學(xué)的研究和無細(xì)胞發(fā)酵的發(fā)現(xiàn)”而獲得諾貝爾化學(xué)獎。畢希納無細(xì)胞發(fā)酵(釀酶)的發(fā)現(xiàn)為現(xiàn)代生物化學(xué)打開了一扇大門，為20世紀(jì)生物化學(xué)的蓬勃發(fā)展奠定了堅實基礎(chǔ)。無細(xì)胞發(fā)酵的重要性主要體現(xiàn)在以下幾個方面：①打破活力論桎梏，是達(dá)爾文進(jìn)化論否定神創(chuàng)論后又一重大進(jìn)步，確立了生命是一個化學(xué)過程，不存在神秘力量，而這正是用化學(xué)方法研究生命問題(生物化學(xué))的基礎(chǔ)；②直接開創(chuàng)了酶學(xué)研究，應(yīng)用無細(xì)胞體系研究酶的作用促使輔酶、糖酵解等的重要發(fā)現(xiàn)，也推動了對酶本質(zhì)的研究；③推動了酶的應(yīng)用，為酶在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用提供了范例。

釀酶發(fā)現(xiàn)為20世紀(jì)酶學(xué)研究提出了許多問題，其中之一就是它的構(gòu)成問題，不久輔酶的發(fā)現(xiàn)大大拓展了對酶的認(rèn)識。

2 輔酶的分離和鑒定

哈登爵士(Sir Arthur Harden)是一位英國生物化學(xué)家，早期接受了系統(tǒng)化學(xué)培訓(xùn)。1897年，哈登加入新建立的英國預(yù)防研究所(1年后更名為詹納研究所，1903年又更名為利斯特研究所)。研究所主要任務(wù)在于培訓(xùn)公共衛(wèi)生官員，此外還進(jìn)行少量科學(xué)研究。1897年釀酶的發(fā)現(xiàn)為哈登提供了研究課題。哈登最初認(rèn)為釀酶可用于細(xì)菌區(qū)分，更多關(guān)注微生物方面的內(nèi)容；但隨著研究的深入，哈登對釀酶本身產(chǎn)生了濃厚興趣，因為他驚奇地發(fā)現(xiàn)極少量酵母液就可將大量蔗糖轉(zhuǎn)化為酒精，酶的催化高效性促使哈登將研究重點放在釀酶的特性方面。

1904年，哈登在與學(xué)生楊(William John Young)合作中發(fā)現(xiàn)一個奇特現(xiàn)象，將煮沸過的酵母汁與過期酵母汁(催化活性明顯下降)混合可增加過期酵母汁的催化能力。當(dāng)時已知煮沸可破壞釀酶活性而喪失催化能力，因此這個實驗暗示酵母汁中含有一些耐熱但對催化必需的物質(zhì)，這些物質(zhì)的特性就成為哈登接下來研究的重點。

哈登和楊利用過濾方法來解決該難題，將具有發(fā)酵活性的酵母汁通過過濾而分成兩部分——濾液和沉淀。他們進(jìn)一步研究后發(fā)現(xiàn)單獨這兩部分均不擁有催化能力，但混合后酶活性恢復(fù)。根據(jù)這一事實哈登得出結(jié)論，酵母的釀酶由兩部分構(gòu)成：一部分是不耐熱大分子物質(zhì)，為酶主要部分；而另一部分是耐熱小分子物質(zhì)，將其命名為釀酶輔酶，又稱輔酶Ⅰ[2]。釀酶輔酶的發(fā)現(xiàn)拓展了對酶的理解，哈登進(jìn)一步證明二磷酸是其重要組成部分，并且還確定無機(jī)磷酸在糖代謝過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，鑒定出6–磷酸葡萄糖(被稱為哈登–楊酯)，這對研究糖代謝具有重要意義。輔酶Ⅰ組成則由瑞典化學(xué)家馮奧伊勒(Hans von Euler-Chelpin)闡明。

馮奧伊勒早期主要接受了物理和化學(xué)的系統(tǒng)訓(xùn)練，進(jìn)入哥廷根大學(xué)后開始了有機(jī)化學(xué)的研究，而第一次世界大戰(zhàn)后他對酶及酶在糖代謝和發(fā)酵過程中的作用產(chǎn)生了濃厚興趣。馮奧伊勒研究發(fā)現(xiàn)有毒物質(zhì)如氟化合物等可抑制輔酶活性，從而影響糖代謝，在此基礎(chǔ)上初步確定了糖酵解的早期反應(yīng)。馮奧伊勒的另一個重點在于研究哈登發(fā)現(xiàn)的釀酶輔酶，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)輔酶不僅在發(fā)酵過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且在人體和動植物中也廣泛分布，這意味著對它們的深入研究具有重要的實際意義。馮奧伊勒發(fā)現(xiàn)酵母是輔酶制備的最理想來源，但從中純化以確定其分子組成仍面臨重大挑戰(zhàn)，1 kg酵母只能得到幾毫克粗制品，因此經(jīng)過多次收集才能獲得達(dá)到實驗要求的較純凈產(chǎn)物。對其分析表明其分子量約490，在結(jié)構(gòu)上與核苷酸非常類似，含有糖、磷酸和嘌呤堿基，深入研究后最終確定輔酶化學(xué)結(jié)構(gòu)實際上是二磷酸嘌呤核苷酸(diphosphopyridine nucleotide, DPN)衍生物[3]。通過對輔酶在不同生物材料中功能的研究，發(fā)現(xiàn)輔酶在動物和植物的酶促反應(yīng)中發(fā)揮極為重要的作用，特別是在一些器官如肌肉、視網(wǎng)膜等具有活躍糖代謝的部位往往含量更多，輔酶作用也遠(yuǎn)比參與發(fā)酵更廣泛。

1929年，哈登和馮奧伊勒由于“糖發(fā)酵和釀酶方面的重要工作”而分享諾貝爾化學(xué)獎(圖2)。他們的研究拓展了人們對糖酵解和酶組成的理解，隨后多種輔酶如金屬離子、ATP和輔酶A等被鑒定成功并闡明生物學(xué)作用，進(jìn)一步突出了輔酶的重要性。

圖2 哈登、馮奧伊勒和輔酶的鑒定

3 輔酶的人工合成

隨著研究深入，人們對輔酶有了較多理解和認(rèn)識，可進(jìn)一步分為無機(jī)離子和小分子有機(jī)化合物，而后者中又以核苷酸輔酶為主，包括三磷酸腺苷(ATP)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)等。為了更好理解這些輔酶的作用機(jī)制，除需知道其組分外，分子結(jié)構(gòu)的闡明也必不可少，英國科學(xué)家托德爵士(Sir Alexander Robertus Todd)就在該領(lǐng)域取得了一系列重大成就。

托德爵士在蘇格蘭格拉斯哥大學(xué)完成學(xué)業(yè)，并在這里接觸到磷化學(xué)，從而為他將來從事核苷酸和輔酶的研究奠定了基礎(chǔ)。20世紀(jì)30年代，托德主要進(jìn)行維生素方面的研究，并成功完成維生素B1的化學(xué)合成。1943年，托德成為劍橋大學(xué)有機(jī)化學(xué)教授，開始核苷和核苷酸(輔酶的重要組分之一)的研究。當(dāng)時已知核苷由一個糖和一種堿基(嘌呤或嘧啶)構(gòu)成，再結(jié)合一個磷酸則構(gòu)成核苷酸，但這些元件如何連接形成核苷酸尚不得而知。糖和堿基都是較復(fù)雜分子，糖上面有4個位置可與堿基或磷酸相連。三種不同元件形成大分子可有多種連接方式，但最終正確的只有一種，傳統(tǒng)有機(jī)化學(xué)和無機(jī)化學(xué)對該問題都無能為力，托德決定解決這個問題。

理解元件間連接的一個重要方法就是通過降解來獲取相關(guān)信息，而另一個更直接的方法則是合成，將合成后化合物與天然產(chǎn)物進(jìn)行對比以確定結(jié)構(gòu)正確與否。這項工作非常復(fù)雜，其中最關(guān)鍵是確定磷酸基團(tuán)的位置，托德為了解決一系列難題，開發(fā)出多種新的合成方法，這些方法也為其他問題的研究帶來巨大便利。最終，托德確定了核苷酸的結(jié)構(gòu)，戊糖的1號位與堿基(嘌呤或嘧啶)相連，而5號位與磷酸相連，形成的核苷酸還可通過3號位與另一核苷酸5號位磷酸結(jié)合而形成二核苷酸，依次通過相同連接方式增加新的核苷酸最終形成多核苷酸分子。這些研究確定了核苷酸和核酸的結(jié)構(gòu)。

托德在研究核苷酸時發(fā)現(xiàn)腺苷在許多輔酶中存在并發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此決定對這些含腺苷化合物進(jìn)行深入探索。1949年，托德成功合成腺苷并隨后合成二磷酸腺苷(ADP)和三磷酸腺苷，此外還合成黃素腺嘌呤二核苷酸等[4]，這些化合物的合成進(jìn)一步深化了對輔酶作用的理解和認(rèn)識(圖3)。

圖3 托德和輔酶化學(xué)合成

1957年，托德由于“在核苷酸及核苷酸輔酶方面的研究成果”而獲得諾貝爾化學(xué)獎，對推動輔酶的研究具有重要意義。

4 酶蛋白的結(jié)晶

酶的小分子組分研究取得一系列重大進(jìn)展的同時，酶的大分子組分也在深入研究，1926年美國生物化學(xué)家薩姆納(James Batcheller Sumner)的脲酶(urease)結(jié)晶實現(xiàn)重大突破。

薩姆納在哈佛大學(xué)完成化學(xué)教育，并進(jìn)一步跟隨生物化學(xué)大師福林(Otto Folin)進(jìn)行研究，選擇“動物體尿素形成機(jī)制”作為博士課題，從而開始脲酶的科研生涯。1914年，薩姆納加入康奈爾大學(xué)開始獨立研究，決定選擇脲酶純化的課題。選擇脲酶主要基于兩個原因：一是薩姆納曾用脲酶作為衡量肌肉、血液和尿液中尿素含量的一個重要指標(biāo)，具有扎實的工作基礎(chǔ)；二是1916年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)一種植物刀豆中富含脲酶，為大量脲酶的制備提供了極大便利。當(dāng)時，大多數(shù)科學(xué)家都認(rèn)為純化酶是個相當(dāng)愚蠢的想法，根本不可能實現(xiàn)，但薩姆納堅定地認(rèn)為酶的純化是一個非常重要的課題，一旦成功將具有十分重大的意義。

前期工作并未像薩姆納預(yù)期的順利，到1921年酶的純化工作依然沒有顯著進(jìn)展，這更增加了同事的質(zhì)疑，但他仍一如既往地堅持著自己的研究。功夫不負(fù)有心人，1926年，薩姆納經(jīng)過多次的摸索和嘗試，終于將自己分離得到的脲酶結(jié)晶化，并且這種結(jié)晶的酶可以重新溶解，溶解后的酶仍具有較強(qiáng)的催化活性，從而說明脲酶的本質(zhì)就是蛋白質(zhì)[5]。

薩姆納將自己分離并結(jié)晶脲酶的結(jié)果發(fā)表后并沒有得到科學(xué)界的認(rèn)可，相反卻遭到一系列質(zhì)疑，主要批評來自于1913年諾貝爾化學(xué)獎獲得者維爾斯塔特(Richard Willstater)及其學(xué)生。他們的實驗小組曾嘗試獲得一種純化的蔗糖酶，但一直未獲成功，因此一直懷疑酶為蛋白質(zhì)。隨后維爾斯塔特小組進(jìn)一步將具有催化活性的溶液進(jìn)行稀釋，同時用化學(xué)方法檢測其中的蛋白質(zhì)含量，當(dāng)溶液稀釋到一定程度后無法再檢測到蛋白質(zhì)存在但溶液依然具有催化活性，據(jù)此他們得出結(jié)論，酶的本質(zhì)不是蛋白質(zhì)。其實該實驗錯誤之處在于蛋白質(zhì)檢測方法的靈敏度不夠，而由于酶本身的高效性，即使少量存在(檢測不到)仍擁有大量酶活性。

維爾斯塔特質(zhì)疑的一個主要依據(jù)是薩姆納所得晶體不純，可能由于少量非蛋白組分附著蛋白質(zhì)表面而使整體具有催化能力。針對這些質(zhì)疑，薩姆納進(jìn)一步對脲酶純化和結(jié)晶，以獲得更理想結(jié)果。隨后幾年中，薩姆納發(fā)表十余篇論文來證明“酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)”。1932年，薩姆納使用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶(pepsin)降解酶溶液中的蛋白質(zhì)，如果酶的本質(zhì)不是蛋白質(zhì)，這種處理將對酶催化能力無影響，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)溶液酶活性完全喪失，從而否定維爾斯塔特的論斷。此外，還有研究人員認(rèn)為脲酶的純化和結(jié)晶可能僅是個特例，不具普遍性。20世紀(jì)30年代，美國另一位生物化學(xué)家諾思羅普(John Howard Northrop)實驗室大量酶結(jié)晶的制備進(jìn)一步證明了薩姆納的正確性。

諾思羅普在哥倫比亞大學(xué)進(jìn)行動物學(xué)和化學(xué)等課程學(xué)習(xí)，最終于1915年獲得化學(xué)哲學(xué)博士，主要進(jìn)行糖代謝研究，因為當(dāng)時的糖酵解研究是生物化學(xué)的一個重要內(nèi)容。第一次世界大戰(zhàn)期間，諾思羅普在美國軍隊服役，為了戰(zhàn)爭和工業(yè)的需要，開始研究乙醇發(fā)酵，并逐漸對酶產(chǎn)生了濃厚興趣。由于當(dāng)時酶的本質(zhì)未知，因此他決定重點研究這個問題。

1896年，派克豪迎(Cornelis Pekelharing)從胃液中分離得到胃蛋白酶，曾打算將其純化和結(jié)晶，但多次實驗都以失敗告終。1920年，諾思羅普重新開始胃蛋白酶結(jié)晶工作，經(jīng)過多次努力也未能成功，從而對“酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)”這個推斷產(chǎn)生動搖，同時維爾斯塔特等的結(jié)果對他也產(chǎn)生了一定影響，因此放棄酶純化研究而轉(zhuǎn)向其他方面。

1926年，薩姆納脲酶結(jié)晶的成功給諾思羅普重新帶來希望，盡管許多科學(xué)家對這個結(jié)論表示懷疑，但諾思羅普堅信這個結(jié)論完全正確，并且對自己當(dāng)初的選擇充滿信心。隨后諾思羅普重新投入胃蛋白酶的純化和結(jié)晶，經(jīng)過實驗方法的改進(jìn)和多次的嘗試，最終于1929年實現(xiàn)結(jié)晶[6]。隨后幾年，諾思羅普擴(kuò)展對酶的研究，到1934年又實現(xiàn)了將胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等的純化和結(jié)晶，證明多種酶的本質(zhì)都是蛋白質(zhì)。薩姆納的成功打開酶本質(zhì)研究大門，而諾思羅普使酶本質(zhì)結(jié)論更加堅實可信，并逐漸為科學(xué)界大部分同行所接受(圖4)。

圖4 薩姆納、諾思羅普和酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)

1946年，薩姆納由于酶結(jié)晶的發(fā)現(xiàn)而獲得該年諾貝爾化學(xué)獎的1/2，諾思羅普則由于純酶形式制備而與斯坦利(Wendell Meredith Stanley)分享另外1/2。薩姆納的工作對化學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)都具有十分重要的意義，推動生物化學(xué)尤其是酶化學(xué)的快速發(fā)展。諾思羅普的進(jìn)一步工作拓展了人們對酶活性及作用機(jī)制的理解和認(rèn)識，極大促進(jìn)了酶學(xué)的研究和應(yīng)用。

5 RNA也具催化活性

1926年酶蛋白的結(jié)晶表明酶本質(zhì)是蛋白質(zhì)，該論斷在20世紀(jì)30年代被接受后成為生物化學(xué)領(lǐng)域一個基本原則，但20世紀(jì)80年代初具有催化活性的RNA的發(fā)現(xiàn)改變了對酶本質(zhì)的認(rèn)識。

1960年，西德尼·奧爾特曼(Sidney Altman)從麻省理工學(xué)院畢業(yè)并獲得物理學(xué)學(xué)士學(xué)位，首先在紐約哥倫比亞大學(xué)物理系獲得一個教學(xué)助手的機(jī)會，從而有機(jī)會接觸到真正的科研。在這里工作的兩年期間，奧爾特曼接觸到并深深喜歡上當(dāng)時最新出現(xiàn)的一個生命科學(xué)交叉學(xué)科——分子生物學(xué)，從而決定從物理學(xué)轉(zhuǎn)向該領(lǐng)域研究。

20世紀(jì)60年代，奧爾特曼先后跟隨分子生物學(xué)大師梅塞爾森(Matthew Meselson，1958年證明了DNA半保留復(fù)制機(jī)制)、布雷內(nèi)(2002年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者)和克里克(DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)者之一，1962年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者)等進(jìn)行DNA研究。20世紀(jì)60年代末，相對于DNA復(fù)制研究，DNA轉(zhuǎn)錄研究逐漸成為研究熱門，主要原因之一在于鑒定出真核生物三種RNA聚合酶。奧爾特曼認(rèn)為該領(lǐng)域的研究將會取得更大成就，因此將研究重心從DNA復(fù)制轉(zhuǎn)向DNA轉(zhuǎn)錄。當(dāng)時已知DNA轉(zhuǎn)錄可產(chǎn)生mRNA、tRNA和rRNA三種分子，奧爾特曼選擇其中最短的tRNA作為研究對象。

奧爾特曼研究發(fā)現(xiàn)，不像大家所認(rèn)為的那樣DNA轉(zhuǎn)錄直接產(chǎn)生成熟tRNA，而是先產(chǎn)生一個比成熟tRNA長的中間產(chǎn)物——前體tRNA，該前體tRNA經(jīng)過隨后一系列加工而將額外部分切除才可轉(zhuǎn)化為成熟tRNA。這個發(fā)現(xiàn)使人們對tRNA的轉(zhuǎn)錄過程認(rèn)識理解更為深刻的同時也開始考慮前體tRNA的加工處理過程，因此奧爾特曼決定先從分離該前體tRNA方面入手。

奧爾特曼通過在大腸桿菌內(nèi)添加有毒化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)突變而最終獲得理想的突變菌株，該細(xì)菌喪失對前體tRNA的加工處理，從而使細(xì)菌內(nèi)前體tRNA出現(xiàn)積累，因此有利于分離。奧爾特曼再借助電泳方法最終分離并純化前體tRNA。對其加工機(jī)理的深入研究發(fā)現(xiàn)該過程需要細(xì)菌內(nèi)的酶催化完成，隨后其他科學(xué)家發(fā)現(xiàn)并分離得到這種酶，并命名為核糖核酸酶P，該酶可將前體tRNA中“多余”序列在精確位置切除形成成熟tRNA。

1971年，奧爾特曼加入美國哈佛大學(xué)，開始深入研究前體tRNA加工處理過程。1978年，奧爾特曼和一名研究生對核糖核酸酶P的研究發(fā)現(xiàn)，該酶由兩部分組成，分別為蛋白質(zhì)和RNA，當(dāng)將RNA去除后，核糖核酸酶P活性喪失，而將RNA重新加入后該酶活性恢復(fù)。該實驗表明RNA在酶的催化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。這個結(jié)果的發(fā)表立刻引起了分子生物學(xué)界的廣泛關(guān)注，因為該結(jié)論與傳統(tǒng)的酶概念不一致。大家都認(rèn)為酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，盡管還需要輔酶發(fā)揮輔助作用，但它們都是小分子物質(zhì)，而像RNA這樣的大分子參與催化過程的現(xiàn)象還從未發(fā)現(xiàn)。盡管如此，這個發(fā)現(xiàn)對傳統(tǒng)觀念的沖擊較小，因為奧爾特曼的結(jié)果僅表明RNA也參與了酶的催化作用[7]，但還沒有排除其中的蛋白質(zhì)的催化作用；因此當(dāng)時的科學(xué)家認(rèn)為其中的RNA可能僅發(fā)揮了輔助作用，發(fā)揮關(guān)鍵催化作用的還是蛋白質(zhì)，這樣還是與傳統(tǒng)觀念相一致。遺憾的是，奧爾特曼并沒有繼續(xù)研究以證明核糖核酸酶P的酶活性完全由RNA來負(fù)責(zé)，直到切赫(Thomas Robert Cech)首先證明單獨RNA在體外也可發(fā)揮催化作用后才重新使該問題得到重視。

切赫在愛荷華州的格林內(nèi)爾(Grinnell)學(xué)院完成其化學(xué)學(xué)業(yè)，期間對生物化學(xué)產(chǎn)生濃厚興趣，生物化學(xué)的實驗設(shè)計、現(xiàn)象觀察和理論解釋都給他留下了深刻印象，因此他決定選擇生物化學(xué)作為未來的職業(yè)。事實證明這是一個非常明智的決定。

1970年，切赫進(jìn)入加州大學(xué)伯克利分校進(jìn)行研究生學(xué)習(xí)，導(dǎo)師是染色體功能和結(jié)構(gòu)研究方面的專家，從而他開始進(jìn)入遺傳信息傳遞研究領(lǐng)域，熟悉DNA和RNA等生物大分子，并掌握了大量生物化學(xué)理論和操作技巧。

1978年，切赫進(jìn)入科羅拉多大學(xué)開始獨立的科學(xué)研究，重點是前體RNA拼接機(jī)制。由于三種RNA中，rRNA比例最大，因此他將rRNA定為研究目標(biāo)。為了更好地實驗，切赫選擇了單細(xì)胞原生生物四膜蟲作為研究對象。選擇四膜蟲基于兩個原因：一是四膜蟲繁殖快，材料容易獲得，并且四膜蟲是真核生物，而真核生物rRNA拼接比較多見；二是四膜蟲易于進(jìn)行RNA提取，大大簡化了核酸操作。事實證明選擇該材料是成功的關(guān)鍵因素之一。

1981年起，切赫和同事開始系統(tǒng)研究前體rRNA的拼接。首先分離并純化了前體rRNA，然后制備了四膜蟲細(xì)胞核提取液，因為切赫最初認(rèn)為負(fù)責(zé)RNA中內(nèi)含子切除的酶應(yīng)存在于細(xì)胞核，然后將不同濃度細(xì)胞核提取液加入到前體rRNA中，還加入一定量的小分子量鹽和能量分子(如ATP)等。此外，還設(shè)計一對照實驗，不加細(xì)胞核提取液，以比較其他實驗組與該對照組的區(qū)別。結(jié)果大大出乎切赫和同事的想象，對照組中也發(fā)生rRNA內(nèi)含子切除反應(yīng)。因為該試管中未添加任何的細(xì)胞核酶類物質(zhì)，只有rRNA自身，因此唯一的解釋就是rRNA實現(xiàn)了自我催化，說明RNA分子自身也具有催化能力。起初切赫和同事對自己的結(jié)果表示懷疑，他們認(rèn)為實驗用的rRNA在純化過程中有部分蛋白質(zhì)殘存，因此可能存在酶類污染。切赫進(jìn)一步強(qiáng)化了實驗，在保證絕對不可能存在蛋白質(zhì)的前提下進(jìn)行rRNA拼接實驗，結(jié)果和當(dāng)初一樣，前體rRNA仍將內(nèi)含子切除。進(jìn)一步研究證明，前體rRNA中的內(nèi)含子發(fā)揮了催化劑作用，切赫將這類擁有催化能力的RNA稱為核酶。

1982年，切赫發(fā)表這一結(jié)果[8]，成為第一個發(fā)現(xiàn)單獨RNA具有催化能力的科學(xué)家。同時切赫的發(fā)現(xiàn)也引起了科學(xué)界一次熱烈的大辯論，一部分懷疑論者努力想保持酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)這個觀點，不愿意接受切赫的結(jié)果，提出一系列懷疑理由。他們認(rèn)為切赫的核酶實際上不是真正意義上的酶，因為它只能作用于自身，并且在反應(yīng)后發(fā)生改變，而真正的酶負(fù)責(zé)催化其他分子反應(yīng)，并且反應(yīng)前后不發(fā)生改變；他們還認(rèn)為rRNA自身拼接可能只是四膜蟲這種奇特生物所擁有的反常現(xiàn)象，在生物界不具有普遍性。

但隨后的一系列發(fā)現(xiàn)使這些懷疑一一破產(chǎn)。世界各地科學(xué)家又在其他多個生物體中發(fā)現(xiàn)rRNA自我拼接現(xiàn)象，說明這一現(xiàn)象具有普遍性。切赫的發(fā)現(xiàn)又重新激發(fā)了奧爾特曼對早期核糖核酸酶P中RNA催化活性結(jié)論的再思考。奧爾特曼在耶魯大學(xué)的一個同事對核糖核酸酶P深入研究后發(fā)現(xiàn)，單獨RNA也可發(fā)揮催化活性。奧爾特曼隨后又證明該RNA擁有經(jīng)典酶所擁有的所有特性，更為重要的是，該酶不像切赫所研究的那樣自我催化，而是催化其他分子反應(yīng)，并且在反應(yīng)前后未發(fā)生改變。這一系列結(jié)果使科學(xué)界接受了RNA也可具有催化活性的事實(圖5)。

圖5 奧爾特曼、切赫和催化RNA的發(fā)現(xiàn)

1989年，奧爾特曼和切赫由于“具有催化活性的RNA的發(fā)現(xiàn)”而分享諾貝爾化學(xué)獎。根據(jù)瑞典皇家科學(xué)院的評述，“兩位科學(xué)家的發(fā)現(xiàn)對于基礎(chǔ)科學(xué)不僅有概念上的重要影響——改變了人們對酶本質(zhì)的認(rèn)識”，諾貝爾委員會甚至將核酶發(fā)現(xiàn)看作1950年后生命科學(xué)領(lǐng)域最重要和最顯著的兩大發(fā)現(xiàn)之一(另一發(fā)現(xiàn)是沃森和克里克的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的闡明)。核酶發(fā)現(xiàn)首先具有重要的理論意義，它擴(kuò)展了對酶本質(zhì)的認(rèn)識，而且還為一個古老的爭論提供了答案。生命起源中一直存在“地球上核酸和蛋白質(zhì)哪一種是最早的生命形式”的爭論。蛋白質(zhì)具有催化性質(zhì)，但它由核酸編碼，而核酸盡管具有編碼功能，但自身缺乏催化功能，單獨存在無法實現(xiàn)復(fù)制，需要蛋白質(zhì)協(xié)助；因此兩者可以說相互依存，看起來不可能先產(chǎn)生任何一種。該爭論也被形象描述為“先有雞還是先有蛋”的問題。RNA擁有催化活性使科學(xué)家推斷RNA是生命起源中的第一個生物大分子，這是因為RNA既可作為遺傳模板，又可發(fā)揮催化劑作用。核酶的發(fā)現(xiàn)還具有重要的應(yīng)用價值。催化性RNA分子為遺傳學(xué)家提供了強(qiáng)有力的工具——基因“剪刀”，使用該“剪刀”可以將目標(biāo)RNA在特定位置切開，在臨床上可用于將導(dǎo)致感染或基因紊亂的RNA分子破壞的目的。

6 核糖核酸酶的研究

核糖核酸酶是一類催化RNA水解的酶，在細(xì)胞內(nèi)RNA成熟和抵御RNA病毒感染方面發(fā)揮重要作用，而對它的研究也誕生了兩項諾貝爾獎。

美國生物化學(xué)家安芬森(Christian Boehmer Anfinsen)1937年畢業(yè)于斯沃思莫爾學(xué)院(Swarthmore College)并獲得文學(xué)士學(xué)位，1943年獲哈佛醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)博士學(xué)位。1950年，安芬森成為美國國家衛(wèi)生研究院心臟研究所細(xì)胞生理和代謝實驗室主任，開始研究牛胰腺核糖核酸酶結(jié)構(gòu)。

1954年，安芬森確定了核糖核酸酶是一個單鏈蛋白，包含8個帶巰基的半胱氨酸，它們可形成4對二硫鍵。當(dāng)時已知二硫鍵對蛋白質(zhì)活性具有重要影響，因此安芬森決定研究核糖核酸酶中二硫鍵的作用。1957年，安芬森和同事發(fā)現(xiàn)用還原劑β–巰基乙醇處理核糖核酸酶后可部分破壞二硫鍵，酶的活性下降，而進(jìn)一步添加變性劑尿素(破壞氫鍵)可造成酶活性完全喪失，這個結(jié)果說明二硫鍵和氫鍵都對核糖核酸酶活性的發(fā)揮具有重要影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)去除這些因素后，酶的活性可以部分恢復(fù)，意味著酶具有部分自我復(fù)性能力。

不久后，安芬森發(fā)現(xiàn)利用氧化去除β–巰基乙醇效應(yīng)(恢復(fù)二硫鍵)但保留尿素情況下可使核糖核酸酶活性恢復(fù)到1%。由于8個半胱氨酸具有形成105種二硫鍵的可能性(7×5×3)，因此隨機(jī)形成正確二硫鍵只有約1%的概率，安芬森證實了這個結(jié)果。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)利用透析先除去尿素，氧化恢復(fù)二硫鍵，核糖核酸酶的活性可恢復(fù)到90%以上，說明所有酶的構(gòu)象都基本完全恢復(fù)(圖6)[9]。安芬森根據(jù)核糖核酸酶的研究結(jié)果及其他蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，得出著名的安芬森定則，即氨基酸序列(蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu))決定蛋白質(zhì)構(gòu)象(蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu))，而構(gòu)象又決定生物學(xué)活性。

圖6 安芬森和安芬森定則

1972年，安芬森由于“在核糖核酸酶特別是氨基酸序列與生物活性構(gòu)象關(guān)聯(lián)的研究”而分享諾貝爾化學(xué)獎的1/2。

美國科學(xué)家穆爾(Stanford Moore)從范德堡大學(xué)獲得化學(xué)學(xué)位后，又于1938年從威斯康星大學(xué)獲得有機(jī)化學(xué)博士學(xué)位，掌握了微量化學(xué)分析法。1939年，穆爾加入洛克菲勒研究所德裔美國生物化學(xué)家貝格曼(Max Bergmann)的實驗室，在這里結(jié)識了后來的科研摯友——斯坦(William Howord Stein)。斯坦先從哈佛大學(xué)獲得化學(xué)學(xué)位，后于1938年從哥倫比亞大學(xué)獲得生物化學(xué)博士學(xué)位，主要研究蛋白質(zhì)的氨基酸分析，畢業(yè)后也進(jìn)入貝格曼實驗室。貝格曼是當(dāng)時世界上最偉大的蛋白質(zhì)化學(xué)家之一，周圍聚集了大量天才的研究人員，主要進(jìn)行氨基酸組成的精確分析。穆爾和斯坦在這里掌握了大量蛋白質(zhì)研究相關(guān)理論和技術(shù)，為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

第二次世界大戰(zhàn)后，紙層析技術(shù)的發(fā)明和蛋白質(zhì)測序方法的進(jìn)展為穆爾和斯坦的蛋白質(zhì)研究帶來重要的推動作用，加速了氨基酸分析和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定的進(jìn)程。斯坦和穆爾發(fā)展了離子交換層析和自動氨基酸分析儀，極大地革新了氨基酸分析手段，進(jìn)入20世紀(jì)50年代后，他們決定測定核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)。

圖7 穆爾、斯坦和酶的結(jié)構(gòu)與功能研究

斯坦和穆爾首先用胰蛋白酶(或凝乳蛋白酶、胃蛋白酶)將核糖核酸酶水解，用層析對獲得的多肽進(jìn)行分離，然后使用埃德曼降解進(jìn)行多肽序列分析，將所得肽段信息利用重疊分析法推導(dǎo)出所有氨基酸信息。1960年，斯坦和穆爾完成了包含124個氨基酸殘基的核糖核酸酶一級結(jié)構(gòu)(圖7)，成為繼胰島素后第二個被解析的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。隨后，斯坦和穆爾還確定了核糖核酸酶中4對二硫鍵的正確連接方式，為安芬森研究提供了重要信息[10]。在測序完成和二硫鍵位置確定的基礎(chǔ)上，斯坦和穆爾應(yīng)用碘乙酸等造成蛋白質(zhì)變性(化學(xué)修飾氨基酸)的方法研究酶活性中心，確定活性中心內(nèi)部和附近多個氨基酸殘基[11]，為理解酶催化機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1972年，穆爾和斯坦由于“對核糖核酸酶化學(xué)結(jié)構(gòu)和活性中心催化活性之間關(guān)聯(lián)的貢獻(xiàn)”而分享諾貝爾化學(xué)獎的另外1/2。

從酶可在體外發(fā)揮活性，到酶由酶蛋白質(zhì)和輔酶兩部分構(gòu)成，再到催化性RNA(核酶)的發(fā)現(xiàn)，人們對酶的本質(zhì)有了越來越深的理解和認(rèn)識，而核糖核酸酶研究中闡明的結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系以及活性中心的概念都為酶學(xué)的蓬勃發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。在此過程中多種酶包括氧化酶、ATP酶類和分子生物學(xué)酶等的鑒定成功，進(jìn)一步凸顯了酶的重要性，也使其應(yīng)用領(lǐng)域獲得了極大拓展。

(2013年9月22日收稿)■

[1] 郭曉強(qiáng), 馮志霞. 無細(xì)胞酵解的發(fā)現(xiàn)及意義[J]. 醫(yī)學(xué)與哲學(xué), 2008, 29(3): 69-70.

[2] HARDEN A, YOUNG W J. The alcoholic ferment of yeast-juice [J]. Proc R Soc Lond B Biol Sci, 1906, 78(526): 369-375.

[3] KYLE R A, SHAMPO M A. Hans von Euler-Chelpin—Noble laureate [J]. Mayo Clin Proc, 1996, 71(6): 596.

[4] SHAMPO M A, KYLE R A, STEENSMA D P. Alexander Todd—British Nobel laureate [J]. Mayo Clin Proc, 2012, 87(3): e19.

[5] SUMNER J B. The isolation and crystallization of the enzyme urease: preliminary paper [J]. J Biol Chem, 1926, 69(2): 435-441.

[6] NORTHROP J H. Crystalline pepsin [J]. Science, 1929, 69(1796): 580.

[7] STARK B C, KOLE R, BOWMAN E J, et al. Ribonuclease P: an enzyme with an essential RNA component [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1978, 75(8): 3717-3721.

[8] KRUGER K, GRABOWSKI P J, ZAUG A J, et al. Self-splicing RNA: autoexcision and autocyclization of the ribosomal RNA intervening sequence of Tetrahymena [J]. Cell, 1982, 31(1): 147-157.

[9] ANFINSEN C B, SELA M, COOKE J P. The reversible reduction of disulfide bonds in polyalanyl ribonuclease [J]. J Biol Chem, 1962, 237: 1825-1831.

[10] KRESGE N, SIMONI R D, HILL R L. The elucidation of the structure of ribonuclease by Stanford Moore and William H. Stein [J]. J Biol Chem, 2005, 280(50): e47-e48.

[11] CRESTFIELD A M, STEIN W H, MOORE S. Alkylation and identification of the histidine residues at the active site of ribonuclease [J]. J Biol Chem, 1963, 238: 2413-2419.

(編輯：沈美芳)

自然信息

無線裝置把“失去”的能量轉(zhuǎn)化為電力：超材料電池可以與太陽能電池媲美

據(jù)2013年11月7日報道，使用低成本的材料配制來捕捉微波信號，Duke大學(xué)Pratt能源研究室的研究者們已經(jīng)設(shè)計出一種強(qiáng)力的聚能裝置可以與現(xiàn)代的太陽能電池板一樣有效。

據(jù)2013年12月的《Applied Physics Letter》報道，一種無線電裝置可以把微波信號轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢越o移動電話電池或其他小型電子設(shè)備充電的直流電壓。

它根據(jù)一種與太陽能電池板把光能轉(zhuǎn)變?yōu)殡娔芟囝愃频幕驹砉ぷ鞯?。但是這種多功能的聚能裝置還可以翻過來變?yōu)閺钠渌茉传@取信息的裝置，例如從衛(wèi)星信號、聲音信號或者Wi-Fi信號獲取信號。研究者如是說。

聚能裝置的關(guān)鍵在于采用了超材料（metamaterial），這種材料經(jīng)過設(shè)計，改變了結(jié)構(gòu)，使之能夠獲取各種形式的微波能量，把它們用到有用的地方。

工科學(xué)生Allen Hawkes和研究生Alexander Katko在電子和計算機(jī)工程教授Steven Cummer的研究指導(dǎo)下，設(shè)計了一種能夠聚集微波能量的電子回路。

他們采用一組由5條玻璃纖維和若干個固定在一塊電路板上的銅質(zhì)能量導(dǎo)體把微波轉(zhuǎn)變成為電壓為7.3 V的電能。相比較而言，小型電子設(shè)備的USB充電器提供的是5 V的電力。

“我們認(rèn)準(zhǔn)了我們能夠獲得最高的能效。”Hawkes說，“我們已能夠獲得的能效在6%～10%范圍，但是，采用這種設(shè)計，我們能夠改進(jìn)能量交換，把能效提高到37%，這可以與我們從太陽能電池獲得的能效相媲美了?！?/p>

“這種設(shè)計方案對于不同頻率和形式的能源都有效，其中包括振動和聲能的聚集。”Katko說，“時至今日，超材料的大量工作還只是停留在理論上。我們展示其中的一小部分工作，這些材料對于消費者使用來說十分有用?！?/p>

例如，一種超材料的涂料可以刷在房間的天花板上用來反射或覆蓋Wi-Fi信號，否則這些信號也就流失了，Katko說。另一種用途是通過無線覆蓋的方法把家用電器原先在使用過程中流失的能量罩起來，從而提高它的能效。

“超材料的特性使設(shè)計具有靈活性，而用一般的類似天線的設(shè)備是做不到的?！盞atko說，“當(dāng)傳統(tǒng)的天線在空中相互靠近時，它們會彼此“講話”，互相對對方的工作產(chǎn)生干涉。然而，創(chuàng)制我們超材料陣的設(shè)計過程已經(jīng)把這些效果考慮在內(nèi)，允許電池彼此組合起來工作?！?/p>

研究者們說，通過進(jìn)一步修改，把聚能的超材料用在手機(jī)上，可以讓手機(jī)在不用的時候無線充電。理論上，這個功能還可以讓人們在不備有常規(guī)電源插座的場所時能夠從附近的手機(jī)信號塔汲取電能。

“我們的工作展示了一種簡單的、廉價的電磁能量收集方法?！盋ummer說，“設(shè)計之美表現(xiàn)在基本的構(gòu)造模塊是獨立的和可添加的，可以簡單地通過增加更多的模塊來提高所獲得的功率?！?/p>

例如，一組聚能模塊組合起來可以從經(jīng)過我們頭頂?shù)娜嗽煨l(wèi)星中截獲信號，研究者解釋說。從這些信號里截獲的少許電量可以給位于偏遠(yuǎn)地區(qū)如山頂或沙漠的一套傳感器網(wǎng)絡(luò)充電，以維持一項長期研究工作的數(shù)據(jù)收集工作。

[雙木 據(jù)《Applied Physics Letters》

2013-11-07]

Enzymes and life sciences (I): understanding the nature of enzyme

GUO Xiao-qiang
Lecturer, Department of Biochemistry, Bethune Military Medical College, Shijiazhuang 050081, China

Enzymes are biological catalysts and involved in almost all life processes by catalyzing chemical reactions. So the studies on enzyme do not only deepen the understanding of life phenomenon, but also provide new treatments for related diseases. It is the discovery of cell-free fermentation in 1897 that initiates modern enzymology. From then, several achievements were made including separation and synthesis of coenzyme, identification on protein nature of enzyme, discovery of catalytic RNA in the following several decades. In addition, the elucidation of primary structure of ribonuclease is important for connection between the amino acid sequence and the biologically active conformation, and connection between chemical structure and catalytic activity. These achievements greatly expand the understanding the nature of enzyme, and scientists who contributed to these were awarded the Nobel Prize.

enzyme, Nobel Prize, coenzyme, protein, catalytic RNA, ribonuclease

10.3969/j.issn.0253-9608.2014.03.009