韓雪梅，李妮妮，李 麗，田弘極，劉松巖＊，武利濤

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，吉林長(zhǎng)春130033；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院）

組織型激肽釋放酶對(duì)大鼠急性腦缺血后GLUT－1表達(dá)的影響

韓雪梅1，李妮妮1，李 麗1，田弘極1，劉松巖1＊，武利濤2

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，吉林長(zhǎng)春130033；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院）

激肽釋放酶－激肽系統(tǒng)（kallikre in－kinin system，KKS）在人體分布廣泛，發(fā)揮重要生理的作用，尤其在血管再生方面發(fā)揮重要作用［1］。本研究通過(guò)觀察組織型激肽釋放酶（TK）對(duì)腦缺血后GLUT－1蛋白表達(dá)的影響，并進(jìn)一步探討TK作為腦保護(hù)劑對(duì)急性腦缺血的治療作用，從而為超過(guò)溶栓治療時(shí)間窗的腦梗死提供新的治療措施，為臨床腦血管病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

選擇健康雄性的Wista大鼠30只，體重250－270g，鼠齡3－5個(gè)月，由長(zhǎng)春市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組，每組10只。假手術(shù)組：只暴露，不插線阻塞大腦中動(dòng)脈；鹽水組（NS組）：大腦中動(dòng)脈持續(xù)永久缺血（PMCAO）后給予生理鹽水，劑量：2ml·kg－1·d－1。治療組（TK組）：大腦中動(dòng)脈永久缺血并注射TK，劑量：17.5×10 3U·kg－1·d－1。給藥方法：在大鼠腦缺血后8h NS、TK腹腔注射給藥，連續(xù)3d。大鼠大腦中動(dòng)脈永久性缺血模型參照Longa等［2］報(bào)道的方法。

1.2 免疫組化

CLUT－1為天津生物試劑公司產(chǎn)品。免疫組化染色采用SP法。試劑盒為福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司產(chǎn)品。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

細(xì)胞計(jì)數(shù)，以單個(gè)標(biāo)本為單位，選取腦內(nèi)3個(gè)區(qū)域（缺血周邊區(qū)、中心區(qū)和對(duì)側(cè)大腦半球），每個(gè)區(qū)域選取3個(gè)200×鏡下視野，進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值，結(jié)果以x—±s表示，各組間比較用方差分析，所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件。

2 結(jié)果

免疫組化顯示：正常對(duì)照組無(wú)GLUT－1蛋白陽(yáng)性表達(dá)。NS對(duì)照組（PMCAO）GLUT－1表達(dá)增強(qiáng)。陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞漿呈棕黃色。在皮層、底節(jié)的神經(jīng)元及血管內(nèi)皮細(xì)胞都有GLUT－1陽(yáng)性表達(dá)。隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，中心區(qū)表達(dá)逐漸下降，而周邊區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，表達(dá)呈逐漸上升趨勢(shì)，缺血3d，GLUT－1在缺血周邊區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的表達(dá)達(dá)高峰，同時(shí)中心區(qū)神經(jīng)細(xì)胞接近正常水平，見(jiàn)圖1。TK治療組：GLUT－1在周邊區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)都顯著增強(qiáng)，與NS對(duì)照組相比差異顯著，P＜0.05，見(jiàn)表1、圖2。

在血管內(nèi)皮細(xì)胞，隨缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，無(wú)論在缺血中心區(qū)還是周邊區(qū)，GLUT－1的表達(dá)均逐漸增強(qiáng)，陽(yáng)性血管數(shù)增多，血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，缺血3d達(dá)高峰，見(jiàn)表2、圖3。

表1 TK對(duì)GLUT－1在缺血周邊區(qū)表達(dá)的影響（ˉx±s，n＝10）

表2 GLUT－1在血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)（n＝10，ˉx±s）

3 討論

腦缺血后的神經(jīng)、血管調(diào)節(jié)機(jī)制尚不完全明確。多個(gè)研究表明激肽釋放酶（KKS）在腦缺血時(shí)促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。它能夠擴(kuò)血管改善循環(huán)，促進(jìn)血管新生，加強(qiáng)神經(jīng)元及神經(jīng)纖維的再生［3］，研究顯示KKS通過(guò)激肽受體降低血壓，神經(jīng)保護(hù)［4，5］。倪耀輝等［6］研究激肽釋放酶在腦缺血后延遲給藥能增加缺血區(qū)NSE陽(yáng)性細(xì)胞，從而證明其腦保護(hù)作用。血管再生在腦組織發(fā)生缺血后誘發(fā)。GLUT－1作為低氧誘導(dǎo)因子－1（HIF－1）的靶基因同樣可以通過(guò)促進(jìn)血管生成、改善缺血區(qū)周?chē)难鞴?yīng)、改善腦內(nèi)葡萄糖代謝從而促進(jìn)腦組織重建。

本研究顯示：正常對(duì)照組無(wú)GLUT－1蛋白陽(yáng)性表達(dá)，NS對(duì)照組（PMCAO）顯示GLUT－1表達(dá)增加，證明了缺血可以誘導(dǎo)GLUT－1的表達(dá)，至缺血后3d，周邊區(qū)的GLUT－1表達(dá)達(dá)高峰。TK組可見(jiàn)GLUT－1在周邊區(qū)表達(dá)上調(diào)，而且表達(dá)GLUT－1的神經(jīng)細(xì)胞多為存活的神經(jīng)元。表明TK能夠促進(jìn)GLUT－1的表達(dá)。因此GLUT－1在腦缺血及TK治療后表達(dá)增加是神經(jīng)元的代償性反應(yīng)，有助于恢復(fù)腦的葡萄糖和氧代謝和穩(wěn)定神經(jīng)元細(xì)胞膜。

圖1 缺血3 d交界區(qū)GLUT－1（組化200×）

圖2 TK治療組3 d周邊區(qū)GLUT－1（組化200×）

圖3 TK治療后GLUT－1在血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)（組化200×）

GLUT－1在血管成分的表達(dá)同樣非常明顯。隨缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，無(wú)論在中心區(qū)還是周邊區(qū)，GLUT－1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，陽(yáng)性血管數(shù)增多，伴有微血管增生。TK治療組GLUT－1在血管內(nèi)皮表達(dá)顯著增強(qiáng)，與鹽水對(duì)照組相比P＜0.05。缺血后，局部血流量急劇減少，腦組織發(fā)生代償性反應(yīng)，葡萄糖載體蛋白的數(shù)目增多，腦血流增加，使腦對(duì)糖的利用保持在正常水平［7］。同時(shí)GLUT－1重新分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞，血管腔內(nèi)面的GLUT－1數(shù)量增多，使腦葡萄糖代謝維持，轉(zhuǎn)運(yùn)增加［8，9］。GLUT－1在血管成分的高表達(dá)是機(jī)體對(duì)缺血缺氧后一種防御反應(yīng)，能夠向缺血腦組織提供更多的葡萄糖，以維持腦的能量代謝［10］。

激肽釋放酶能夠促進(jìn)多種血管生長(zhǎng)因子及肝細(xì)胞性生長(zhǎng)因子（HGF）的生成和釋放［11］。本實(shí)驗(yàn)顯示：TK治療組缺血周邊區(qū)新生血管增多，GLUT－1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)數(shù)量及強(qiáng)度均增強(qiáng)，表明TK可以促進(jìn)血管生成，并與通過(guò)上調(diào)GLUT－1的表達(dá)有關(guān)。

［1］Emam iN，Diam and isEP.Human tissue kallik reins：A road un－derconstrat ion［J］.Clin Chin Acta，2007，381（1）：78.

［2］Longa EZ，Weintein PR，Carson S，et al.Rerersible middle Cerebral aetery occlusion without crainietomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84.

［3］Xia CF，Yin H，Yao YY，et al.Kallikrein protects against ischemic stroke by inhibiting apoptosis and inflammation and promoting angiogenesis and neurogenesis［J］.Hum Gene Ther，2006，17：206.

［4］Xia CF，Yin H，Borlongan CV，et al.Kallikrein gene transfer protects afainst ischemic stroke by promoting glial cell migration and inhibiting apoptosis［J］.Hypertension，2004，43：452.

［5］Murakami H，Yayama K，Miao RQ，et al.Kallikrein gene delivery inhibits vascular smooth muscle cell growth and neointima formation in the rat artery after balloon angioplasty［J］.Hypertension，1999，34：164.

［6］倪耀輝，丁素菊.組織型激肽釋放酶對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)和血管的影響［J］.中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志，2009，35（3）：173.

［7］Nehlig A.Cerebral energy metabolism，glucose transport and blood flow：changes with maturation and adaptation tohypoglycaemia［J］.Diabetes Metab，1997，23（1）：18.

［8］Simpson IA，Appel NM，Hokari M，et al.Blood－brain barrier glucose transporter：effects of hypo－and hyperglycemia revisited［J］.J Neurochem，1999，72（1）：238.

［9］Dobrogowska DH，Vorbrodt AW.Quantitative immunocytochemical study of mouse brain［J］.J Histochem Cytochem，1999，47（8）：1021.

［10］Regina A，Morechoisne S，Borson ND，et al.Factors released by glucose deprived astrocytes enhance glucose transporter expression and activity in rat brain endothelia cells［J］.Biochim Biophys Acta，2001，1540（3）：233.

［11］Milkiewicz M，Ispanovic E，Doyle JL，et al.Regulators of angiogenesis and strategies for their therapeutic manipulation［J］.Int J Biochem Cell Biol，2006，38：333.

2013－10－16）

1007－4287（2014）07－1052－02

吉林省科技廳社會(huì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（No.20090463）

＊通訊作者