嚴 鵬 任麗娟 成 振 郭大瑋▲ 白麗娟 賈琳娜

1.山西醫(yī)科大學法醫(yī)學院，太原 030001；2.山西大醫(yī)院，太原 030032

MSRE-qPCR法檢測少弱精子癥患者父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平

嚴 鵬1任麗娟2成 振1郭大瑋1▲白麗娟1賈琳娜1

1.山西醫(yī)科大學法醫(yī)學院，太原 030001；2.山西大醫(yī)院，太原 030032

目的 建立精子中父源印記基因H19上游區(qū)域MSRE-qPCR檢測方法，并分析男性少弱精子癥患者精子父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平。 方法 收集20例正常精液樣本，同時篩選30例少弱精子癥患者精液樣本，應用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶法并結(jié)合定量PCR對所有樣本父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平進行分析。 結(jié)果 正常精液樣本父源印記基因H19上游區(qū)域平均甲基化率為（99.8±2.72）%，高于少弱精子癥患者精液樣本的（82.4±15.30）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。 結(jié)論MSRE-qPCR法可用于父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平的檢測，少弱精子癥者精液樣本父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平顯著低于正常人。

印記基因H19；MSRE-qPCR；少弱精子癥；DNA甲基化

目前，全球約15%的育齡夫婦存在不孕不育，其中與男性相關(guān)的因素約占50%，同時該比例還在逐年增加[1]。導致男性不育的主要因素為精子異常，包括少精子癥、弱精子癥和畸形精子癥等，已有學者研究證明父源印記基因H19甲基化狀態(tài)可影響男性精子的生成，且甲基化狀態(tài)降低會導致男性精子的生成障礙[2]，因此可認為父源印記基因H19甲基化狀態(tài)的異?？蓪е履行圆挥?。近年來，有關(guān)精子基因甲基化狀態(tài)的研究逐漸增多，研究方法多是從半定量水平或間接定量水平進行分析，直接從定量水平進行分析的較少。本研究將甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶法與定量PCR相結(jié)合，建立精子中父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平定量分析方法，同時篩選30例少弱精子癥患者精液樣本，對其父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化狀態(tài)進行分析，探討父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平異常與男性不育的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 精液樣本采集

根據(jù)《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第五版）[3]的標準，收集20例正常精液樣本，同時篩選30例少弱精子癥患者精液樣本，精液樣本均來源于2013年11～12月在山西醫(yī)科大學附屬第一臨床醫(yī)院就診的患者。

1.2 精子DNA提取

采用經(jīng)典酚-氯仿法提取精子全基因組DNA，并用紫外分光光度法檢測所提取DNA的純度及濃度。

1.3 MSRE處理

采用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶HhaⅠ（New England Biolabs）對所提取精子DNA進行酶切消化，同時對于同一精液樣本以去離子水代替HhaⅠ設(shè)立未消化對照，酶切體系：精子基因組DNA為1～20 ng，HhaⅠ為30 U，加入適量Buffer，去離子水補至20 μl，37℃消化16 h，65℃消化20 min停止酶切。

1.4 PCR引物設(shè)計及擴增條件

根據(jù)相關(guān)文獻報道，選擇人類H19基因上游區(qū)域一段包含4個HhaⅠ酶切位點的區(qū)域作為第一輪常規(guī)PCR擴增區(qū)域，該區(qū)域所包含的4個HhaⅠ酶切位點在精子DNA中均為高甲基化狀態(tài)，在該區(qū)域兩翼設(shè)計引物，上游引物5′-GGGTCATTATAGACGCAATCG-3′，下游引物5′-AGAACCTGTTGGGCGGTTAGA-3′，擴增產(chǎn)物長度為1700 bp左右[4]。擴增體系：ExTaq Hot Start Version（Takara）為1.25 U，dNTP混合物（Takara）的終濃度為10 mmol/L each，模板為已消化好（對照組為未消化）的精子DNA 4 μl，引物的終濃度為10 μmol/L each，加入適量緩沖液，去離子水補至50 μl。常規(guī)PCR擴增條件：95℃預變性3 min；94℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸2 min，共20個循環(huán)，72℃再延伸5 min。同時以上一步常規(guī)PCR引物為模板使用Premier Premier 6.0軟件設(shè)計第二輪qPCR引物，上游引物5′-CTGGGAACACTGGGA AAG-3′，下游引物5′-AGAAACTGGGCTGATTGG-3′，擴增產(chǎn)物長度為147 bp，擴增體系：2×SYBRRPremix Ex TaqⅡ（Takara）為10 μl，引物的終濃度為10 μmol/L each，取上一步常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物稀釋20倍后取1 μl作為模板，去離子水補至20 μl。qPCR擴增條件：95℃預變性30 s，95℃變性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s，共35個循環(huán)，結(jié)束后繪制溶解曲線。

1.5 甲基化水平分析

采用標準曲線相對定量法對精液樣本甲基化水平進行分析，以百分數(shù)表示甲基化水平，甲基化水平=（消化組定量結(jié)果/未消化組即對照組定量結(jié)果）× 100%。標準曲線構(gòu)建采用父源印記基因H19標準質(zhì)粒（來源于山西醫(yī)科大學法醫(yī)學院），標準質(zhì)粒經(jīng)梯度稀釋后與精液樣本同時擴增，繪制標準曲線。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理，計量資料以±s表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MSRE-qPCR方法評估

2.1.1 HhaⅠ酶切效率評估 以H19標準質(zhì)粒檢測酶切效率，將50、200、400 ng的H19標準質(zhì)粒以HhaⅠ消化16 h后進行MSRE-qPCR分析，同時設(shè)計未消化對照，酶切效率=[（未消化定量結(jié)果-消化定量結(jié)果）/未消化定量結(jié)果]×100%，結(jié)果HhaⅠ對50、200、400 ng的H19標準質(zhì)粒的酶切效率分別為99.9%、99.9%、99.8%。

2.1.2 PCR引物擴增評估 本研究所設(shè)計qPCR引物，其線性范圍寬，擴增靈敏度高，擴增效率為103.9%，相關(guān)系數(shù)可達0.999，引物特異性好，在Tm=87.3℃時出現(xiàn)單一產(chǎn)物峰；擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證，兩對引物均擴增特異性好，條帶清晰（圖1）。

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果

2.2 樣品中父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化狀態(tài)的分析

20例正常精液樣本父源印記基因H19上游區(qū)域均為高甲基化狀態(tài)，平均甲基化率為（99.8±2.72）%；30例少弱精子癥患者精液樣本父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化狀態(tài)顯著降低，平均甲基化率為（82.4± 15.30）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在30例少弱精子癥患者精液樣本中，有5例樣本甲基化率為97% ～100%，8例樣本甲基化率為90%～97%，11例樣本甲基化率為 70%～90%，3例樣本甲基化率為 50%～70%，2例樣本甲基化率為30%～50%，1例樣本甲基化率為＜20%（圖2）。

圖2 少弱精子癥患者父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平分布

3 討論

甲基化作為表觀遺傳學的重要研究內(nèi)容之一，是蛋白質(zhì)和核酸的一種重要修飾，與生長發(fā)育、衰老、癌癥及許多疾病密切相關(guān)[5-6]，近年來，研究發(fā)現(xiàn)，在精子發(fā)生過程中，DNA甲基化起著重要作用[7]。DNA甲基化的修飾依賴DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 （DNA methyltransferase，DNMT），有研究發(fā)現(xiàn)DNMT3L敲除的雄性小鼠無生育能力，母鼠的卵子也不能建立正確的印記基因，后代在胚胎期即死亡[8]，Hata等[9-10]的研究指出，DNMT3A、DNMT3L缺陷的小鼠可表現(xiàn)為少精子癥。Li 等[11]在研究中觀察到與正常人相比，少弱精子癥患者的精子質(zhì)量越差，精子DNA甲基化水平越低。Kobayashi等[12]研究了97例不育男性的精液，發(fā)現(xiàn)其中有14.4%的樣本存在父系甲基化印記H19、GTL2的異常。Marques等[2]也指出精子中H19基因甲基化異常程度越嚴重，精子的異常率越高。精子中H19基因甲基化的異常，可導致精子發(fā)生異常，進而導致男性不育。

輔助生育技術(shù) （assisted reproductive technology，ART）可以避開自然受精過程中多種天然屏障而解決男性不育問題。有研究證明精子DNA甲基化的異常并不影響試管嬰兒的受孕率，但精子DNA甲基化的異?？捎绊懪咛サ陌l(fā)育，進而可能導致后代出現(xiàn)各種遺傳疾病[13]。Hansen等[14]的研究表明，通過人工授精懷孕的嬰兒，出生一年內(nèi)被診斷出有嚴重生理缺陷的概率是自然懷孕所產(chǎn)嬰兒的3倍，因此在進行ART前應對精子的甲基化狀態(tài)進行仔細分析，以降低ART的風險。

精子DNA甲基化狀態(tài)研究的主流方法是依賴重亞硫酸鹽修飾并結(jié)合其他相關(guān)技術(shù)進行甲基化狀態(tài)的分析，主要包括重亞硫酸測序、甲基化特異性PCR、甲基化特異性單核苷引物延伸、重亞硫酸鹽限制酶組合分析等[15-17]。重亞硫酸鹽可以將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，這些方法可以很好的分析相關(guān)基因中CpG島的甲基化狀態(tài)，但是其多操作復雜，工作量大，且在定量方面存在一定局限性。本研究使用MSRE-qPCR法分析精子中父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平，其方法操作簡便，線性范圍寬，靈敏度高，重復性好，可以快速、定量地分析精子中父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平，基本可以達到科研及臨床檢測的要求。本研究結(jié)果顯示，少弱精子癥患者精子DNA中父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平與正常精子有顯著差異，提示精子DNA H19上游區(qū)域甲基化水平與少弱精子癥有一定相關(guān)性，且少弱精子癥者精子中父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平顯著低于正常人。

綜上所述，本研究所建立的方法可以快速、定量地分析精子中父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平，下一步研究除繼續(xù)篩選不育男性精子中甲基化異常的代表性基因外，還應對不育男性精子DNA中甲基化水平達到多少即可進行ART而不會產(chǎn)生其他問題等展開深入研究。

[1]Carrell DT.Elucidating the genetics of male infertility:understanding transcriptional and translational regulatory networks involved in spermatogenesis[J].Int J Androl，2008，31 （5）：455-456.

[2]Marques CJ，F(xiàn)rancisco T，Sousa S，et al.Methylation defects of imprinted genes in human testicular spermatozoa [J].Fertile Steril，2010，94（2）：585-594.

[3]World Health Organization.WHO Laboratory manual for the examination and processing of human semen[M].Fifth edition.Geneva：World Health Organization，2010.

[4]Naito E，Dewa K，F(xiàn)ukuda M，et al.Novel paternity testing by distinguishing parental alleles at a VNTR locus in the differentially methylated region upstream of the human H19 gene[J].J Forensic Sci，2003，48（6）：1275-1279.

[5]Robertson KD.DNA methylation and human disease[J].Nat Rev Genet，2005，6（8）：597-6l0.

[6]Secko D.How an imprint can lead to cancer[J].CMAJ，2005，172（10）：1286.

[7]Santos F，Dean W.Epigenetic reprogramming during early development in mammals[J].Reproduction，2004，127（6）：643-651.

[8]Bourc′his D，Xu GL，Lin CS，et al.Dnmt3L and the establishment of maternal genomic imprints[J].Science，2001，294 （5551）：2536-2539.

[9]Hata K，Okano M，Lei H，et al.Dnmt3L cooperates with the Dnmt3 family of de novo DNA methyltransferases to establish maternal imprints in mice[J].Development，2002，129 （8）：1983-1993.

[10]Kaneda M，Okano M，Hata K，et al.Essential role for de novo DNA methyltransferase Dnmt3a in paternal and maternal imprinting[J].Nature，2004，429（6994）：900-903.

[11]Li ZX，Ma X，Wang ZH，et al.A differentially methylated region of the DAZ1 gene in spermatic and somatic cells [J].Asian J Androl，2006，8（1）：61-67.

[12]Kobayashi H，Sato A，Otsu E，et al.Aberrant DNA methylation of imprinted loci in sperm from oligospermic patients[J].Hum Mol Genet，2007，16（21）：2542-2551.

[13]Benchaib M，Braun V，Ressnikof D，et al.Influence of global sperm DNA methylation on IVF results[J].Hum Reprod，2005，20（3）：768-773.

[14]Hansen M，Kurinczuk JJ，Bower C，et al.The risk of major birth defects after intracytoplasmic sperm injection and in vitro fertilization[J].N Engl J Med，2002，346（10）：725-730.

[15]HermanJG，GraffJR，MyohanenS，et al.Methylation-specific PCR:a novel PCR assay for methylation status of CpG islands[J].Proc Natl Acad Sci USA，1996，93（18）：9821-9826.

[16]Gonzalgo ML，Jones PA.Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE)[J].Nucleic Acids Res，1997，25（12）：2529-2531.

[17]Xiong Z，Laird PW.COBRA:a sensitive and quantitative DNA methylation assay[J].Nucleic Acids Res，1997，25（12）：2532-2534.

The methylation level detection of the upstream of H19 paternal imprinted gene in olig-asthenospermia patient by MSRE-qPCR

YAN Peng1REN Li-juan2CHENG Zhen1GUO Da-wei1▲BAI Li-juan1JIA Lin-na1
1.Forensic Medicine of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2.Shanxi Dayi Hospital,Taiyuan 030032,China

ObjectiveTo establish the methylation level of upstream of H19 paternal imprinted gene in semen of oligasthenospermia patient and analyse the methylation level detection of the upstream of H19 paternal imprinted gene in olig-asthenospermia patient.MethodsThe methylation level in the upstream of the H19 paternal imprinted gene of abnormal(30 olig-asthenospermia samples)and normal(20 normal semen samples)was detected respectively by conducting the methylation sensitive restriction endonucleases-quantitative polymerase chain reaction(MSRE-qPCR,asemiquantitative DNA methylation analytical method).ResultsThe average methylation rate in the upstream of the H19 paternal imprinted gene in normal semen samples was(99.8±2.72)%,higher than that in olig-asthenospermia samples(82.4±15.30)%, with statistical difference(P＜0.01).ConclusionThe method of MSRE-qPCR can be used in the methylation level detection of upstream of the H19 paternal imprinted gene of semen,and the methylation level of upstream of the H19 paternal imprinted gene in olig-asthenospermia patient is much lower than that in normal person.

H19 paternal imprinted gene;MSRE-qPCR;Olig-asthenospermia;DNA methylation

R698

A

1674-4721（2014）03（c）-0012-04

2014-02-11本文編輯：李亞聰）

教育部高等學校博士學科點專項科研基金（2011 1417110003）

▲通訊作者