李琳琳申緋翡馬雷雷李亞東*

(1 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700；2 洛陽職業(yè)技術學院，河南 洛陽 471000；3 北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，北京100029)

黃芪注射液對人胚肺成纖維細胞增殖及細胞外基質(zhì)合成的干預作用

李琳琳1申緋翡2馬雷雷1李亞東3*

(1 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700；2 洛陽職業(yè)技術學院，河南 洛陽 471000；3 北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，北京100029)

目的 觀察黃芪注射液對體外培養(yǎng)人胚肺成纖維細胞增生以及細胞外基質(zhì)合成的影響。方法 用0～400 mg/mL濃度的黃芪注射液作用于體外培養(yǎng)的人胚肺成纖維細胞，24～72 h后觀察不同濃度的黃芪注射液對成纖維細胞增殖活性及其功能的影響。MTT法觀察成纖維細胞的生長活性，天狼猩紅染色觀察膠原生成情況。結果 與對照組相比，在25～200 mg/mL濃度作用下，黃芪注射液對成纖維細胞的生長具有促進作用；在400 mg/mL濃度作用下，黃芪注射液能夠明顯抑制人胚肺成纖維細胞的增殖。結論 黃芪注射液在高濃度條件下抑制人胚肺成纖維細胞的生長，中低濃度下促進成纖維細胞的生長，呈現(xiàn)劑量依賴性。

黃芪注射液；人胚肺成纖維細胞；細胞外基質(zhì)

肺纖維化的形成與肺組織反復損傷后的過度修復有關，表現(xiàn)為肺ECM合成與降解穩(wěn)態(tài)失衡，尤其是膠原代謝失衡[1]。在病理改變方面以成纖維細胞增殖及大量ECM沉積為特征[2]。因此，尋找有效藥物抑制肺成纖維細胞的過渡增生是防治肺纖維化的重要手段之一。《神農(nóng)本草經(jīng)》載黃芪，性微溫，味甘，歸脾、肺經(jīng)，有補氣升陽，益衛(wèi)固表，托毒生肌，利水退腫之功效。黃芪用途廣泛，可用于脾肺氣虛或中氣下陷之癥，衛(wèi)氣虛所致表虛自汗，氣血不足所致癰疽不潰或潰久不斂，浮腫尿少，氣虛血滯所導致的肢體麻木、關節(jié)痹痛和氣虛津虧的消渴等癥。現(xiàn)代藥理研究表明黃芪的主要化學成分有黃芪多糖、皂苷類、黃酮類和氨基酸等。本實驗主要觀察黃芪注射液對體外培養(yǎng)條件下的人胚肺成纖維細胞的生長增殖和膠原合成的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

人胚肺成纖維細胞（MRC-5）購置中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院細胞中心；MEM/NEAA培養(yǎng)液購置中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院；胰酶購于Sigma公司；胎牛血清購于Gibco公司；黃芪注射液購置成都地奧九泓制藥廠，每支10 mL（相當于原生藥材20 g）；0.1%天狼猩紅苦味酸染液購置北京海德生物科技有限公司；噻唑藍（MTT），二甲基亞砜（DMSO）購置北京科海軍舟有限公司；熒光倒置顯微鏡為日本尼康公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱，SANYO公司；酶標儀，為美國B.D公司產(chǎn)品。

1.2 細胞的培養(yǎng)

MRC-5細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的MEM/NEAA培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的CO2育箱中培養(yǎng)，96 h長滿瓶底，3～4 d更換1次培養(yǎng)液，傳代。

1.3 黃芪注射液對MRC-5增生的影響

采用MTT法檢測。取對數(shù)生長期的MRC-5，胰酶37 ℃消化5 min，以10%胎牛血清的MEM/NEAA培養(yǎng)液制備成1×105/mL細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)液板中，每孔200 μL，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞長至單層后，分別在細胞中加入不同濃度的藥物培養(yǎng)液，同時設不加藥的陰性對照和只加培養(yǎng)液的空白對照，每組設10個復孔。分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入200 μL DMSO，輕微震蕩10 min，使MTT完全溶解，于自動酶標儀490 nm波長處測定各孔吸光度A值。

1.4 膠原的檢測[3]

取對數(shù)生長期的成纖維細胞，用MEM/NEAA培養(yǎng)液調(diào)整細胞數(shù)為1×105/mL，接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，37 ℃、5% CO2及飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后在各組細胞中加入含有不同濃度的藥物培養(yǎng)液，另設不加藥的正常對照組，每組設10個復孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加甲醇100 μL，-20 ℃固定一夜，PBS洗1次，天狼猩紅染1 h，0.1%醋酸洗3次，每孔加入0.1 μmol/L NaOH 20 μL，室溫震蕩1 h，置于酶標儀540 nm處檢測。

2 結 果

2.1 黃芪注射液對體外培養(yǎng)人胚肺MRC-5細胞增殖的影響

見表1。MTT結果：黃芪注射液濃度為400 mg/mL時能顯著抑制MRC-5生長（P＜0.05）。25～200 mg/mL的濃度范圍對MRC-5的生長具有促進作用。說明黃芪注射液對人胚肺成纖維細胞的生長增殖既可促進又可以抑制，呈劑量依賴性。

表1 黃芪注射液對體外培養(yǎng) MRC-5細胞生長的影響()

表1 黃芪注射液對體外培養(yǎng) MRC-5細胞生長的影響()

注：與對照組相比較，P＜0.05

組別 劑量 A值24 h 48 h 72 h對照組 0 0.259±0.01 0.476±0.03 0.575±0.05實驗組 25 0.275±0.03 0.524±0.02 0.675±0.02實驗組 50 0.294±0.02 0.534±0.04 0.739±0.02實驗組 100 0.325±0.02 0.554±0.03 0.745±0.03實驗組 200 0.305±0.10 0.515±0.03 0.599±0.01實驗組 400 0.236±0.05 0.355±0.01 0.373±0.02

2.2 鏡下觀察成纖維細胞形態(tài)的變化

對照組的細胞密度低時，細胞長梭形或三角形，有多個細胞質(zhì)突起（圖1）；細胞密度高時，以長梭形為主，排列緊密，呈放射狀或渦旋狀，邊界不清（圖2）。用藥組的細胞：25～200 mg/mL濃度下的細胞形態(tài)與對照組差別不大，僅生長速度快于對照組；400 mg/mL濃度下的細胞數(shù)量明顯減少，細胞皺縮，細胞邊緣變鈍，細胞間隙增寬，分布松散，甚至可以看到漂浮的死亡細胞（圖3）。

2.3 膠原測定結果

隨著黃芪注射液的濃度增加，與對照組相比，當濃度在25～200 mg/mL時，成纖維細胞的膠原生成量有所增加，而在400 mg/mL濃度時，成纖維細胞的膠原生成量明顯減少。結果見表2。

圖1 對照組細胞低密度照片

圖2 對照組細胞高密度照片

圖3 400 mg/mL濃度下細胞照片

表2 不同濃度的黃芪注射液對體外培養(yǎng)MRC-5細胞的ECM影響()

表2 不同濃度的黃芪注射液對體外培養(yǎng)MRC-5細胞的ECM影響()

注：與對照組相比較，P＜0.05

組別 劑量（mg/mL） 吸光度對照組 0 0.403±0.018黃芪注射液組 25 0.426±0.054黃芪注射液組 50 0.434±0.047黃芪注射液組 100 0.505±0.032黃芪注射液組 200 0.436±0.047黃芪注射液組 400 0.242±0.016

3 討 論

肺纖維化是多種原因引起的慢性肺系疾病的共同結局，是多種肺系疾病發(fā)展到晚期的共同病理變化。其集中表現(xiàn)為成纖維細胞的異常增殖和細胞外基質(zhì)的過度沉積。在肺部，細胞外基質(zhì)的主要成分之一膠原即來自于活化的成纖維細胞。由于成纖維細胞的異常增殖及膠原的分泌增加在肺纖維化過程中起著重要作用[4]，因此，抑制肺成纖維細胞增殖是防治肺纖維化的一種有效手段。

本實驗以人胚肺成纖維細胞為靶細胞，研究黃芪注射液對成纖維細胞形態(tài)及膠原表達的影響。結果發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液在中低濃度條件下對成纖維細胞的生長有促進作用，在高濃度條件下則有抑制作用。提示其可能有預防或延緩肺纖維化疾病進程的作用。有研究表明，在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，Ⅰ、Ⅲ型膠原合成與降解失衡起主要作用，在肺泡炎癥階段或肺纖維化早期主要以Ⅲ型膠原增加為主，此期病變尚可逆轉，隨后病變轉為慢性，則以Ⅰ型膠原沉積為主，形成不可逆轉的改變[5,6]。天狼腥紅染液能與膠原緊密吸附，反應極其穩(wěn)定，染色后不褪色，有特異性，是目前膠原染色最好的染料。在普通光鏡下觀察，膠原纖維呈紅色。

綜上所述，黃芪注射液在中低濃度下能夠促進成纖維細胞的生長，高濃度下可以抑制成纖維細胞的生長，因此可以延緩肺纖維化的進程。同時提示黃芪對人體的作用具有雙向性。

[1] ArauJo CC,Leon LL.Biological activities of Curcuma longal[J]. Meminst Oswald Cruz,2001,96(4):7232-7238.

[2] 陳珍旭,吳蓉易.葛根素對實驗性大鼠肺纖維化影響[J].臨床肺科雜志,2006,11(4):4232-4236.

[3] Brnton MH,Kopp JB.TGFβ-1 and Fibrosis[J].Microbes Infect,19 99,1(15):1349-1365.

[4] 趙洪文.肺成纖維細胞在肺纖維化中的作用[J].國外醫(yī)學·呼吸系統(tǒng)分冊,1996,16(3):116-117.

[5] 侯杰,戴令娟.川芎嗪、丹參治療大鼠肺纖維化對Ⅰ、Ⅲ型前膠原基因表達的影響[J].中華結核和呼吸雜志,1999,22(1):43-44.

[6] 何玉先,劉秉慈.實驗性矽肺纖維化組織中Ⅰ、Ⅲ型前膠原基因的表達[J].基礎醫(yī)學與臨床,1994,14(6):43-46.

R28

B

1671-8194（2014）18-0086-02

國家自然基金資助項目（項目編號：81202787）

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