楊海玉 于 濤 楊愛成 廖曉春

（廣東省江門市五邑中醫(yī)院，廣東 江門 529030）

丹參酮ⅡA磺酸鈉對2型糖尿病大鼠心肌TNF-α mRNA表達的影響*

楊海玉 于 濤△楊愛成 廖曉春

（廣東省江門市五邑中醫(yī)院，廣東 江門 529030）

目的評價丹參酮ⅡA磺酸鈉對2型糖尿病大鼠心肌腫瘤壞死因子（TNF）-α mRNA表達的影響，探討其對糖尿病心肌病的保護機制。方法 將大鼠隨機分為正常組、模型對照組及丹參酮ⅡA磺酸鈉組。成模后丹參酮ⅡA磺酸鈉組給藥12周，留取血及心肌標本用放免法檢測各組大鼠血漿TNF-α，RT-PCR方法檢測心肌組織中NF-κB、TNF-α mRNA表達水平。結果模型對照組大鼠血漿中TNF-α水平較正常對照組明顯升高（P＜0.01），且心肌組織中NF-κB、TNF-α mRNA表達較正常對照組明顯增加（P＜0．01）。給藥12周后，丹參酮ⅡA磺酸鈉組心肌組織中NF-κB、TNF-α mRNA表達較模型對照組明顯降低，兩組之間差異顯著（P＜0.05）。結論丹參酮ⅡA磺酸鈉可能通過抑制2型糖尿病大鼠心肌組織中NF-κB通路，減少TNF-α mRNA表達，對2型糖尿病大鼠心肌提供保護作用。

糖尿病心肌病 丹參酮ⅡA磺酸鈉 腫瘤壞死因子-α 核因子-κB

糖尿病心肌病是一種獨立的糖尿病心血管并發(fā)癥，它是糖尿病引起心臟微血管病變和心肌代謝紊亂所致的心肌廣泛局灶性壞死，早期通常表現為舒張功能不全，晚期以收縮功能不全為主，易發(fā)生充血性心力衰竭［1］，但其發(fā)病機制十分復雜，至今仍未完全闡明。糖尿病時高血糖可通過多種途徑激活機體炎癥反應，是導致糖尿病繼發(fā)性病變的重要原因。本實驗通過建立2型糖尿病大鼠模型，觀察循環(huán)中腫瘤壞死因子（TNF）-α和心肌中NF-κB、TNF-α mRNA的表達水平，研究丹參酮ⅡA磺酸鈉的干預作用，進一步探討2型糖尿病心肌病的保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物 成年健康Wistar雄性大鼠30只，體質量180～220g，由南方醫(yī)科大學動物研究中心提供。

1.2 藥物與試劑 丹參酮ⅡA磺酸鈉由上海第一生化藥業(yè)提供，實驗時以蒸餾水配制成所需濃度；鏈脲佐菌素（STZ），由廣州捷倍斯生物科技有限公司提供。

1.3 分組與造模 30只健康雄性Wistar大鼠適應性飼養(yǎng)1周，按抽簽法隨機選取10只大鼠為正常對照組，給予普通飼料。其余20只大鼠為進行造模，給予高糖高脂飼料（蔗糖∶豬油∶奶粉∶雞蛋∶普通飼料=30∶20∶4∶2∶63，質量比）喂養(yǎng)。1月后以小劑量STZ 25 mg/kg，溶于0.1 mol／L枸櫞酸緩沖液（pH4.4）一次性腹腔注射誘導大鼠模型。正常組僅腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液，后每日以同體積蒸餾水灌胃1次。模型組在腹腔注射STZ 2周后斷尾測空腹血糖，連續(xù)2次＞7.8 mmol／L者為糖尿病大鼠。

1.4 給藥方法 造模成功的糖尿病大鼠再編號按抽簽法隨機分為模型對照組、丹參酮ⅡA磺酸鈉組，各10只。于成模后第2日，丹參酮ⅡA磺酸鈉組大鼠每天按10 mg/kg體質量腹腔注射丹參酮ⅡA磺酸鈉，其余2組給予等體積蒸餾水腹腔注射，實驗周期為12周。

1.5 標本采集與檢測 第12周結束時，禁食12～14 h，測定血糖（羅氏羅康全活力型血糖儀）后，10％烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠。腹主靜脈取血測血脂、血漿Ins水平及TNF-α；迅速取出心臟，冰鹽水沖洗后稱左心室質量，取部分左心室組織置于10％中性甲醛固定，供蘇木精-伊紅（HE）染色；另取部分心肌置于液氮中留做心肌NF-кB、TNF-α mRNA的檢測。（1）血漿TNF-α的測定：采用放射免疫法，藥盒由上海英駿生物技術有限公司提供。（2）心肌中NF-кB、TNF-α mRNA表達檢測：采用RT-PCR方法檢測mRNA的表達水平。引物序列依據文獻報道設計，由上海英駿生物技術有限公司提供。β-肌動蛋白（β-actin）：上游引物5′-ATTG TCAGCAATGCATCCTG-3′，下游引物5′-ATGGACTGTgGTCATGAGCC-3′；TNF-α：上游引物5′-TGCCTCAG CCTCTTCTCATT-3′；下游引物5′-CCCATTTGGGAAC TTCTCCT-3′；NF-кB：上游引物 5′-CGCCTCAGAATCGgCTCTTG-3′；下游引物5′-TCCACTCGGAT ACTAGTCgC-3′。反應體系（25 μL）：SYBR Premix Ex TAQTM（2×）12.5 μL，D H2O 8.5 μL，cDNA 2 μL，PCR Forward Prime （10 μmol/L）1 μL，PCR Rervise Prime（10 μmol/L）1 μL。TNF-α基因擴增條件為：95℃，3 min（1個循環(huán)）；95℃，20 s，60℃，40 s（40個循環(huán)）；NF-кB基因擴增條件為：95℃3 min，然后95℃40 s，60℃40 s（35個循環(huán)）。以β-actin作為內參，取PCR產物凝膠成像后用圖像分析系統(tǒng)分析結果。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s）表示，采用t檢驗、χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組空腹血糖（FPG）、血脂、血漿胰島素（Ins）和TNF-α水平比較 見表1。模型對照組大鼠FPG、血漿Ins、TG和TNF-α水平均明顯高于正常對照組（P＜0.01）；與模型對照組比較，丹參酮ⅡA磺酸鈉組各指標均有下降，其中TNF-α下降明顯，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表1 各組FPG、血漿Ins、血脂及TNF-α水平比較（±s）

表1 各組FPG、血漿Ins、血脂及TNF-α水平比較（±s）

與正常對照組比較，#P＜0.01；與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組 別 n FPG（mmol/L）Ins（mU/L）TG（mmol/L）TNF-α（μg/L）正常對照組 10模型對照組 10 5.81±1.27 13.4±2.6 0.58±0.11 3.21±0.77 22.15±4.30# 23.2±5.6# 4.17±0.93# 6.44±1.81#丹參酮ⅡA磺酸鈉組 10 19.98±3.37 21.5±4.3 3.85±0.81 4.34±1.26**

2.2 各組大鼠心肌組織病理變化 見圖1。正常組大鼠心肌細胞排列整齊、致密，結構清晰，細胞核呈卵圓形；模型對照組大鼠心肌疏松，淡染，提示大鼠心肌纖維腫脹，排列紊亂，空泡變性，有炎癥細胞浸潤；丹參酮ⅡA磺酸鈉組心肌細胞排列趨于整齊，結構接近正常。

圖1 各組大鼠心肌組織病理變化（×200）

2.3 各組大鼠心肌 NF-κB、TNF-α mRNA的表達見表2。給藥12周后，丹參酮ⅡA磺酸鈉組心肌組織中NF-κB、TNF-α mRNA表達較模型對照組明顯降低，兩組之間差異顯著（P＜0.05）。

表2 各組NF-κB、TNF-α mRNA比較（±s）

表2 各組NF-κB、TNF-α mRNA比較（±s）

組 別 n NF-кB TNF-α mRNA正常對照組 10 0.33±0.11 0.44±0.10模型對照組 10 0.61±0.21# 0.74±0.25#丹參酮ⅡA磺酸鈉組 10 0.43±0.14* 0.51±0.18*

3 討論

心血管并發(fā)癥是糖尿病相關的病死率和發(fā)病率的主要原因［2］。糖尿病心肌病是一種獨立于冠心病及高血壓之外的糖尿病心血管并發(fā)癥［3］。目前認為發(fā)病機制復雜，炎癥反應可能是其重要發(fā)病環(huán)節(jié)之一［4］。本研究發(fā)現，模型對照組大鼠心肌病理學切片顯示心肌疏松，淡染，心肌纖維腫脹，排列紊亂，空泡變性，有炎癥細胞浸潤，提示炎癥反應參與了糖尿病心肌病過程。研究發(fā)現，NF-κB是對炎癥、免疫調節(jié)較為敏感的轉錄因子，活化可產生大量的炎癥介質，引起炎癥反應的發(fā)生。糖尿病大鼠胰島素抵抗、糖脂代謝異常，導致NF-κB的激活，激活NF-κB信號通路的級聯反應，進一步導致氧化應激的增加，從而擴大心肌局部炎癥損傷，引起心肌線粒體功能障礙并發(fā)心功能不全［5-6］。本研究表明，模型對照組大鼠糖脂代謝明顯異常，血TNF-α水平及其心肌NF-κB、TNF-α mRNA表達均顯著高于正常組，進一步證實了NF-κB、TNF-α mRNA表達是糖尿病心肌炎癥損害重要機制。

研究表明［7］，丹參酮ⅡA具有干預炎癥反應作用，能夠降低左心室心肌中TNF-α的表達以及肥厚心肌細胞中NF-κB的表達，同時通過抗氧化減輕TNF-α對心肌細胞的損傷。本研究病理切片發(fā)現，丹參酮ⅡA磺酸鈉組心肌細胞排列趨于整齊，結構接近正常。前期研究亦發(fā)現丹參酮ⅡA磺酸鈉對糖尿病大鼠心功能具有保護作用。上述研究結果提示，丹參酮ⅡA磺酸鈉對糖尿病大鼠心肌具有保護作用。本研究中，丹參酮ⅡA磺酸鈉組大鼠糖脂水平比模型對照組下降，但差異顯示統(tǒng)計學意義，提示丹參酮ⅡA對心肌保護作用是降糖脂外的作用；與模型對照組對比，丹參酮ⅡA磺酸鈉組糖尿病大鼠不但循環(huán)中TNF-α水平明顯降低，心肌中NF-КB、TNF-α mRNA表達也顯著降低，這與文獻研究基本一致［8］。本研究結果表明丹參酮ⅡA磺酸鈉可能通過抑制糖尿病大鼠心肌的NF-кB通路，抑制TNF-α mRNA表達，從而發(fā)揮對心肌的保護作用。

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Effect of TanshinoneⅡA Sulfonate Sodium on TNF-α m RNA Expression in Rats w ith Type-ⅡDiabetic M yocardium

YANG Hai-Yu，YU Tao，YANG Ai-Cheng，et al.Jiangmen Wuyi Traditional Chinese Medicine Hospital，Guangdong Province，Guangdong，Jiangmen 529030，China

Objective：To evaluate the effect of tanshinoneⅡA sulfonate sodium on TNF-α mRNA expressions in myocardium of rats with type-Ⅱdiabetics and further discuss the protective mechanism of diabetic cardiomyopathy. M ethods：Wister rats were random ly divided into normal controlgroup（NC），model controlgroup（DM）and tanshinoneⅡA sulfonate sodium treatmentgroup（DMS）.After rats model was established and STS was administrated for 12 weeks.Specimens of blood and myocardium in rats were reserved for detecting serum TNF-α by radio immunoassay and expressions of NF-κB（Nuclear factor-kappa B）、TNF-α mRNA in myocardium by RT-PCR.Results：Compared with the NCgroup，the level of TNF-α in DMgroup elevated（P＜0.01）.Compared with the NCgroup，the NF-κB and TNF-α mRNA expressions in myocardium of DMgroup significantly increased （P＜0.01）．However，the NF-κB and TNF-α mRNA expressions in myocardium of DMSgroup after 12 weeks treatment were less than those of DMgroup，showing statistical differences （P＜0.05）.Conclusion：TanshinoneⅡA sulfonate sodium can reduce TNF-α mRNA expressions in myocardium of rats with type-Ⅱdiabetics by inhibition of NF-κB pathway and protect the diabetic rats′myocardium.

Diabetic cardiomyopathy；TanshinoneⅡA sulfonate sodium；TNF-α；NF-κB

R285.5

A

1004-745X（2014）03-0440-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.03.025

2013-12-10）

廣東省江門市科技局資助課題（20107514）

△通信作者