鄭宏

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，北京 100007）

血塞通注射液對(duì)缺氧缺糖/再灌注SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷的影響*

鄭宏

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，北京 100007）

目的觀察血塞通注射液對(duì)缺氧缺糖/再灌注SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷的影響。方法 采用MTT比色法（四唑鹽比色實(shí)驗(yàn)）測(cè)定線(xiàn)粒體活性，流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡細(xì)胞百分率，觀察不同劑量血塞通注射液（血塞通0.0781 μL、0.0391 μL、0.0195 μL）對(duì)神經(jīng)細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷的影響。結(jié)果神經(jīng)細(xì)胞缺氧缺糖4 h再給氧12 h、24 h細(xì)胞線(xiàn)粒體活性明顯降低，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯增加。血塞通注射液0.0781 μL、0.0391 μL組與模型組比較在線(xiàn)粒體活性12 h OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），0.0391 μL組測(cè)定24 h OD值仍有明顯差異（P＜0.05）。血塞通0.0781 μL、0.0391 μL組12 h的神經(jīng)細(xì)胞凋亡率與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；0.0391 μL、0.0195 μL組24 h的神經(jīng)細(xì)胞凋亡率與模型組差異明顯（P＜0.01）。結(jié)論不同劑量血塞通注射液能夠明顯提高神經(jīng)細(xì)胞線(xiàn)粒體活性，并且不同程度抑制經(jīng)細(xì)胞凋亡率的增加。

血塞通注射液 神經(jīng)細(xì)胞凋亡 線(xiàn)粒體損傷

缺血性腦血管的病理?yè)p害主要包括缺血性和缺血/再灌注性損害，兩者可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡。近年研究發(fā)現(xiàn)，線(xiàn)粒體損傷是缺血性腦細(xì)胞損傷過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)［1］。線(xiàn)粒體又是細(xì)胞核外唯一含DNA的細(xì)胞器，凋亡是由線(xiàn)粒體DNA和核DNA相互作用、雙重調(diào)控的病理生理過(guò)程［2］。因此線(xiàn)粒體是缺血再灌注腦損傷的重要靶目標(biāo)［3］。本實(shí)驗(yàn)選用SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞，采用缺氧缺糖/再灌注的方法，模擬人體缺血再灌注損傷，觀察中藥血塞通注射液（三七提取物三七總皂苷）對(duì)缺氧缺糖/再灌注SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞線(xiàn)粒體活性損傷、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的影響，探討其作用環(huán)節(jié)及機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)器材 培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，血清為Hyclone公司產(chǎn)品，碘化丙啶和MTT為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，尼莫地平為山東新華制藥有限公司產(chǎn)品，血塞通注射液為黑龍江珍寶島制藥有限公司產(chǎn)品。5％CO2培養(yǎng)箱：德國(guó)HERAEUS-BB16型。超凈工作臺(tái)：北京半導(dǎo)體設(shè)備儀器廠JJT1300型。倒置相差顯微鏡：日本OLYMPUS IMT-2型。低速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn)LD4-2型。移液器：芬蘭Labsystems Finnpipette系列。流式細(xì)胞儀：美國(guó)BD公司FACS Calibur型。

1．2 種板 SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞用含100％胎牛血清、100 U/mL的青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。鏡下觀察細(xì)胞約90％匯合時(shí)，用消化液消化細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，96孔板每孔100 μL細(xì)胞懸液，T25培養(yǎng)瓶每瓶5 mL細(xì)胞懸液，放入37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 缺氧缺糖/再?gòu)?fù)氧模型分組及給藥方法 每種藥物濃度根據(jù)MTT藥物毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行選擇。各藥物組棄去原培養(yǎng)液，用無(wú)糖Earle’s液洗細(xì)胞2次，96孔板內(nèi)換入的藥物終濃度分別為每100 μL無(wú)糖Earle’s含尼莫地平2.5 μL、1.25 μL、0.625 μL，血塞通0.0781 μL、0.0391 μL、0.0195 μL；T25培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)藥物濃度分別為每100μL無(wú)糖Earle’s含尼莫地平12.5μL，血塞通0.781μL、0.391μL、0.195μL；正常組換成無(wú)糖Earle’s液。于37℃缺氧箱內(nèi)缺氧培養(yǎng)4 h，后換入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)12 h、24 h復(fù)氧。正常組在模型組及各藥物組缺氧時(shí)進(jìn)行正常培養(yǎng)，后與模型組和各藥物組一起換成無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h、24h。

1.4 線(xiàn)粒體活性的測(cè)定 采用MTT比色法測(cè)定線(xiàn)粒體活性。96孔板中的各組細(xì)胞經(jīng)缺氧/缺糖再給氧和藥物處理后，吸棄各孔培養(yǎng)液，加入無(wú)血清培養(yǎng)基100 μL，再加入20 μL MTT，混勻，37℃溫育4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，震蕩10 min，充分溶解有活性的細(xì)胞中生成的藍(lán)色顆粒。用酶標(biāo)儀在550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，酶標(biāo)儀自動(dòng)打印結(jié)果。根據(jù)結(jié)果進(jìn)行細(xì)胞線(xiàn)粒體活力的測(cè)定。

1.5 凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù) 經(jīng)消化液消化收集細(xì)胞懸液后，1000×g離心5 min，棄上清液，用PBS洗1次，用70％乙醇4℃冰箱內(nèi)固定12 h以上。取固定后的細(xì)胞用0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液洗2遍并懸浮，后加入終質(zhì)量濃度為20 mg/L的RNaseA，37℃恒浴1 h，再加入PI染液至終質(zhì)量濃度50 mg/L，搖勻后4℃避光靜置1 h，在FACS Calibur型流式細(xì)胞儀上計(jì)數(shù)1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，測(cè)定凋亡細(xì)胞所占比例。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 各組線(xiàn)粒體活性比較 見(jiàn)表1。與正常組相比，模型組神經(jīng)細(xì)胞缺氧缺糖4 h再給氧12 h、24 h細(xì)胞線(xiàn)粒體活性降低（P＜0.05或P＜0.01），提示缺氧缺糖/再給氧損傷可明顯造成神經(jīng)細(xì)胞線(xiàn)粒體的損傷；血塞通注射液能夠明顯提高神經(jīng)細(xì)胞線(xiàn)粒體活性。

2．2 各組缺氧缺糖/再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較見(jiàn)表2。神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)缺氧缺糖4 h再給氧12 h、24 h后神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯增加，尼莫地平1.25 μL組和血塞通各劑量組能夠不同程度抑制經(jīng)細(xì)胞凋亡率的增加，與模型組相比有顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。

3 結(jié)論

近年來(lái)，中醫(yī)藥在治療缺血性腦損傷顯示了良好的前景，已引起國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)的重視，但從線(xiàn)粒體入手的研究還不多。線(xiàn)粒體是產(chǎn)生和儲(chǔ)存ATP的場(chǎng)所，在缺血缺氧條件下，一方面，線(xiàn)粒體酶活性的改變影響到線(xiàn)粒體的呼吸功能［4］，使線(xiàn)粒體不能有效合成ATP；另一方面，線(xiàn)粒體從胞漿攝取過(guò)量的Ca2+，導(dǎo)致線(xiàn)粒體Ca2+升高［5］，使氧化磷酸化效率降低，ATP合成減少。因此，線(xiàn)粒體損傷導(dǎo)致的能量代謝障礙是缺血性腦細(xì)胞損傷過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。線(xiàn)粒體作為細(xì)胞核外唯一含DNA的細(xì)胞器，還對(duì)細(xì)胞凋亡起著中心調(diào)控作用，細(xì)胞凋亡過(guò)程中的許多關(guān)鍵環(huán)節(jié)都與線(xiàn)粒體密切相關(guān)，如線(xiàn)粒體膜電位的喪失［6］，導(dǎo)致氧化磷酸化脫偶聯(lián)，氧自由基生成增多而細(xì)胞凋亡；線(xiàn)粒體內(nèi)重要的細(xì)胞凋亡蛋白細(xì)胞色素C的釋放［7］，使Caspase家族活化，激活脫氧核糖核酸酶，水解核酸及細(xì)胞骨架蛋白，最終引起細(xì)胞凋亡。

表1 各組缺氧缺糖4 h復(fù)氧12 h、24 h線(xiàn)粒體OD值比較（±s）

表1 各組缺氧缺糖4 h復(fù)氧12 h、24 h線(xiàn)粒體OD值比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組 別 12 h正常組 0.194±0.015**模型組 0.140±0.016尼莫地平2.5 μL組 0.147±0.008 24 h 0.190±0.019*0.167±0.011 0.143±0.020尼莫地平1.25 μL組 0.165±0.010** 0.176±0.019尼莫地平0.625 μL組 0.169±0.005** 0.181±0.008*血塞通0.0781 μL組 0.171±0.020** 0.161±0.012血塞通0.0391 μL組 0.194±0.021** 0.199±0.010**血塞通0.0195 μL組 0.146±0.011 0.142±0.009

表2 各組神經(jīng)細(xì)胞缺氧缺糖4 h復(fù)氧1 2 h、2 4 h神經(jīng)細(xì)胞凋亡率（％，x±s）

表2 各組神經(jīng)細(xì)胞缺氧缺糖4 h復(fù)氧1 2 h、2 4 h神經(jīng)細(xì)胞凋亡率（％，x±s）

組 別 12 h正常組 3.40±0.80**模型組 15.01±0.64 24 h 3.40±0.80**17.44±0.81尼莫地平1.25 μL組 8.04±0.48* 7.89±0.50*血塞通0.0781 μL組 5.59±1.19** 7.44±1.07*血塞通0.0391 μL組 5.89±0.72** 5.12±0.28**血塞通0.0195 μL組 7.19±0.46* 5.27±0.48**

血塞通注射液主要成分為三七總皂苷，臨床具有保護(hù)心肌、抗心率失常、抗休克、降低動(dòng)脈血壓、抑制血小板聚集、增加心腦血流量等多方面的作用。實(shí)驗(yàn)研究表明三七總皂苷能降低細(xì)胞LDH的釋放，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，使細(xì)胞凋亡及壞死神經(jīng)元百分率明顯降低，對(duì)缺血再灌注損傷的神經(jīng)元有保護(hù)作用［8］。本實(shí)驗(yàn)選用SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)，采用缺氧缺糖/再灌注的方法，模擬人體缺血再灌注損傷，觀察不同劑量血塞通注射液對(duì)缺氧缺糖/再灌注SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞線(xiàn)粒體活性損傷的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，血塞通注射液能夠不同程度地提高神經(jīng)細(xì)胞線(xiàn)粒體活性，并且不同程度抑制經(jīng)細(xì)胞凋亡率的增加。

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Influences of Xuesaitong Injection on Hypoxia/hypoglycem ia and Neuronal M itochondria Damage w ith SH-SY5Y Reperfusion

ZHENG Hong.Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China

Objective：To observe the influences of Xuesaitong Injection on hypoxia/hypoglycemia and neuronal mitochondria apoptosis with SH-SY5Y-reperfusion.M ethods：Mitochondrion activity was detected by methyl thiazolyltetrazolium test（MTT）.The apoptosis percentage was detected by flow cytometry to observe different influenceson neuronal mitochondria damage based on different density of Xuesaitong Injection used（0.0781 μL，0.0391 μL and 0.0195 μL）.Results：After hypoxia-hypoglycemia treating for 4 hours and reoxygenation treating for 12 and 24hours，the neuron mitochondrion activity was decreased significantly.On the other hand，the apoptosis rate of neurons had distinct increase.Conclusion：Xuesaitong Injection with various density could enhance neuronal mitochondria activity significantly and inhibit the increase of neuron apoptosis percentage accordingly.

Xuesaitong Injection；Neuron apoptosis；Mitochondrial damage

R285.5

A

1004-745X（2014）03-0437-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.03.024

2013-12-09）

北京中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)課題（2005X72）