何 劍，雍曉雨，2，周 俊，2，王舒雅，2，陳怡露，鄭 濤，2

(1.南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，南京 211800;2.南京工業(yè)大學 生物能源研究所，南京 211800)

γ-多聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，γ-PGA)是由微生物利用D-和/或L-型谷氨酸單體通過α-氨基和γ-羧基之間的酰胺鍵聚合而成的一種天然帶負電和的高分子聚合物［1］，最先在炭疽芽胞桿菌的莢膜中發(fā)現(xiàn)［2］。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)有多種生物在代謝過程中能夠合成γ-PGA，包括古細菌(Natrialba aegyptiaca)、細菌(Bacillus subtilis natto、B.subtilis subsp.chungkonkjang、B.licheniformis ATCC9945、B.anthracis和 B.megaterium WH320)和 動 物(Hydra)［3］，其中以芽胞桿菌類最普遍。γ-PGA 及其衍生物在食品、化工、材料和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有極大的開發(fā)價值和廣闊的應(yīng)用前景［4］。

γ-多聚谷氨酸結(jié)構(gòu)獨特，很難通過化學方法合成;酶轉(zhuǎn)化法雖然工藝路線簡單、周期短，但合成的γ-PGA相對分子質(zhì)量較小，制約了該方法的生產(chǎn)實際應(yīng)用;提取法制備γ-PGA的含量不穩(wěn)定且副產(chǎn)物多、成本也較高，不利于大規(guī)模生產(chǎn)，因此目前獲得γ-PGA最有效的途徑是通過微生物發(fā)酵［5］。目前，用于研究 γ-多聚谷氨酸生產(chǎn)的典型菌株主要有 Bacillus licheniformis ATCC9945a(從土壤中分離得到)和Bacillus subtilis IFO3335(從豆制品中分離得到)等［6］。Jeong等［7］報道了 1 株B.subtilis RKY3經(jīng)過24 h發(fā)酵，γ-PGA產(chǎn)量達到48.7 g/L，但相對分子質(zhì)量僅為 6.2×104;Cao等［8］報道了 1 株 B.amyloliquefaciens LL3，雖經(jīng)過44 h發(fā)酵生產(chǎn)的γ-PGA相對分子質(zhì)量為4.7×105，但產(chǎn)量僅有4.4 g/L;由于菌株產(chǎn)率較低、營養(yǎng)條件要求苛刻，難以大規(guī)模生產(chǎn)，例如Ashiuchi等［9］發(fā)現(xiàn) Bacillus subtilis subsp.chungkookjang 在含有200 g/L谷氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，γ-PGA的產(chǎn)量僅能達到13.5 g/L，因此，篩選優(yōu)良的 γ-PGA生產(chǎn)菌種尤為重要［10］。本文旨在從土壤中自主分離出一株高產(chǎn)γ-PGA的菌種，為γ-PGA的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 分離試樣

土樣采集自江蘇省南京市玄武區(qū)某菜園土。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體篩選培養(yǎng)基 (g/L):檸檬酸10、谷氨酸10、NH4Cl 6、K2HPO41、MgSO4·7H2O 0.5、FeCl3·6H2O 0.02、CaCl20.2、MnSO4·H2O 0.05、瓊脂20;pH 7.2。

種子液培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10、酵母膏5、NaCl 10;pH 7.0。

液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L):檸檬酸13.5、谷氨酸10、NH4Cl 6.8、甘油 75、K2HPO41、MgSO4·7H2O 0.5、FeCl3·6H2O 0.02、CaCl20.2、MnSO4·H2O 0.05;pH 7.2。

斜面保存培養(yǎng)基 (g/L):蛋白胨10、酵母膏5、NaCl 10、瓊脂20;pH 7.0。

以上培養(yǎng)基在121℃ 條件下高壓蒸汽滅菌15～20 min。

1.1.3 主要試劑和儀器

培養(yǎng)基所用試劑(分析純)，上海國藥集團化學試劑有限公司;rTaq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、pMD19-T Vector，寶生物工程(大連)有限公司;細菌基因組DNA快速提取試劑盒，廣州東盛生物科技有限公司;DNA凝膠回收試劑盒、PCR清潔試劑盒，愛思進生物技術(shù)(杭州)有限公司;PCR儀，美國Bio-Rad公司;CX21光學顯微鏡，日本奧斯巴林公司;NDJ-5S數(shù)字式黏度計，上海壘固儀器有限公司;冷凍干燥儀，美國Virtis公司;Biochrom 30全自動氨基酸分析儀，英國Biochrom公司;色譜工作站為美國Agilent 1200系統(tǒng)，配置Shodex 101示差折光檢測器;SB-806M HQ型凝膠滲透色譜柱，Shodex公司。

1.2 菌株篩選

稱取土樣10 g，放入裝有90 mL無菌水及玻璃珠的三角瓶內(nèi)，室溫下150 r/min振蕩混勻30 min后，沸水浴 3 ～5 min，再依次制成 10－1、10－2、10－3、10－4、10－5和 10－6不同稀釋度的土壤懸液，涂布于固體篩選培養(yǎng)基上，最后將平板置于37℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。從平板上挑選黏度較大，且能夠拉絲的菌落，劃線接種到固體篩選培養(yǎng)基上，檢查其特征是否一致，同時將細胞涂片染色后用顯微鏡檢查是否為單一的微生物。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需要再一次進行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。純培養(yǎng)菌種劃線接種于斜面保存培養(yǎng)基上，4℃ 保存，每隔一個月轉(zhuǎn)接活化1次。

1.3 液體發(fā)酵液的黏度測定

接種環(huán)挑取1環(huán)平板上單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，30℃、170 r/min培養(yǎng)16 h，按5%接種量接種到液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中(1/5裝液量)，30℃、170 r/min搖床培養(yǎng)48 h后用NDJ-5S型數(shù)字式黏度計測定發(fā)酵液黏度。

1.4 γ-PGA的提取與純化

發(fā)酵液10 000 r/min離心30 min后，取上清，加入4倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，靜置過夜，12 000 r/min離心，沉淀用去離子水溶解后，透析過夜，冷凍干燥得到固體初提物。初提物用去離子水溶解，12 000 r/min離心，上清加20 mg/mL蛋白酶K，去離子水透析過夜，再按上述方法離心，取上清冷凍干燥，得到γ-PGA固體純化試樣，-70℃ 保存。

1.5 γ-PGA的水解

取純化的γ-PGA試樣0.2 g放入水解管中，加入10 mL 6 mol/L的HCl，抽真空，維持10 min后封口，110℃ 水解24 h，冷卻后過濾，再用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀濃縮，洗提3次，最后定容到10 mL，每一步均采用超純水進行處理，取最終定容的濾液分析游離谷氨酸含量。

1.6 γ-PGA水解產(chǎn)物的分析

采用Biochrom 30全自動氨基酸分析儀對水解產(chǎn)物進行分析，上樣量為20 μL。

1.7 γ-PGA相對分子質(zhì)量測定

1)相對分子質(zhì)量標準曲線的繪制 利用凝膠滲透色譜法(GPC)對γ-PGA相對分子質(zhì)量進行測定。色譜條件:流動相0.2 mol/L Na2SO4，乙酸調(diào)節(jié)pH至4.0;流速1.0 mL/min;柱溫35℃;紫外檢測波長210 nm;進樣體積20 μL。采用Shodex公司的葡聚糖標準品，根據(jù)出峰時間繪制標準曲線并擬合出相對分子質(zhì)量計算方程:Y=－19 010+173 200 000 000Exp(－0.831 5X)，其中X為試樣在紫外檢測器上的保留時間，Y為試樣的相對分子質(zhì)量。γ-PGA相對分子質(zhì)量標準曲線見圖1。

圖1 Shodex葡聚糖標準品相對分子質(zhì)量標準曲線Fig.1 Standard curve of molecular weight of Shodex standard

2)相對分子質(zhì)量測定 取一定量發(fā)酵液適當稀釋，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾去除菌體，備用。色譜條件同上。

1.8 生理生化鑒定

菌體形態(tài)特征和生理生化特征測定參照文獻［11］進行。

1.9 菌株16S rDNA鑒定

1)16S rDNA基因序列的PCR反應(yīng) 使用東盛公司的細菌基因組DNA快速提取試劑盒提取菌株C1的基因組DNA后，用細菌16S rDNA基因通用引物27F/1541R(正向引物27F:5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物1541R':5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件:94℃ 預(yù)變性5 min，94℃ 變性45 s，55℃ 退火45 s，72℃ 延伸90 s，32個循環(huán)，再72℃ 延伸10 min。擴增完畢用8 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物大小。使用愛思進公司的DNA凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行清潔回收。

2)16S rDNA基因序列測序 上述提取的含16S rDNA基因的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切分析后，挑選具有正確大小插入片段的質(zhì)粒進行測序，測序委托南京金斯瑞生物科技有限公司測定。

3)系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將目的菌株16S rDNA測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST，并與GenBank數(shù)據(jù)庫做相似性分析，利用MEGA 4.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹圖。

1.10 菌株合成γ-PGA功能基因的PCR擴增

根據(jù)文獻［12］合成γ-PGA的功能基因團pgsBCA序列，設(shè)計3對合成γ-PGA的基因引物，見表1。

表1 基因pgsA、pgsB和pgsC的擴增引物Table 1 Primers for amplification of gene pgsA，pgsB，and pgsC

PCR反應(yīng)體系除所用引物不同外，其他與16S rDNA基因序列的PCR反應(yīng)相同。PCR產(chǎn)物用8 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物大小。

2 結(jié)果與討論

2.1 γ-PGA產(chǎn)生菌的篩選

γ-PGA是一種生物源的高分子聚合物，其表觀典型特征就是其黏度較大。因此，進行大量的初篩菌株時，通常普遍選用的方法是對其菌落和發(fā)酵液的表觀現(xiàn)象進行檢測。例如，惠明等［6］采用該方法篩選出了8株表觀黏度較大的菌種，并最終通過復(fù)篩獲得了1株γ-PGA高產(chǎn)菌株B.subtilis B53。筆者利用選擇性培養(yǎng)基從土壤試樣中分離培養(yǎng)出菌落較黏稠且能拉絲的菌株共39株。通過液體發(fā)酵培養(yǎng)基復(fù)篩，選取發(fā)酵液黏度較大的菌株7株，將這7株細菌經(jīng)多次劃線純化及鏡檢后，斜面保存。

對保存的7株細菌進行搖瓶發(fā)酵試驗，并測定其發(fā)酵液黏度值，結(jié)果見表2。由表2可知:菌株C1的黏度值為154.3 mPa·s，在所有篩選出的菌種中最大。因此，選擇C1作為進一步研究的對象。

表2 菌株C1搖瓶產(chǎn)物的黏度值Table 2 Viscosity value of the fermentation flask culture of strain C1

2.2 菌株C1搖瓶發(fā)酵γ-PGA的產(chǎn)量測定

從C1菌株搖瓶發(fā)酵液提取純化得到白色絮狀的γ-PGA純品，按1.5方法將其水解并進行氨基酸分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知:經(jīng)純化后的水解產(chǎn)物基本上全為游離谷氨酸(18.4 g/L)，占總氨基酸的96%，其他氨基酸含量可以忽略不計，即C1菌株在液體搖瓶培養(yǎng)基中的產(chǎn)量可達到18.4 g/L。且經(jīng)過幾次傳代培養(yǎng)后證明，其產(chǎn)量穩(wěn)定。合成γ-PGA的細菌根據(jù)培養(yǎng)基中是否需要添加外源谷氨酸可分為兩組，即非谷氨酸依賴性和谷氨酸依賴性，前者培養(yǎng)基中不需要添加外源谷氨酸，而后者合成γ-PGA嚴格依賴于培養(yǎng)基中添加的外源谷氨酸。B.subtilis var. polyglutamicun［13］、 B.licheniformis A35［14］和 B.licheniformis S173［15］均為非谷氨酸依賴性的菌株。然而，γ-PGA產(chǎn)生菌仍以谷氨酸依賴性居多，如:B.subtilis IFO 3335［16］、B.licheniformis ATCC 9945A［17］、B.subtilis MR-141［18］、B.subtilis subsp.chungkookjang［9］和 B.subtilis F-2-01［19］。由上述結(jié)果可知，篩選的菌株C1為1株谷氨酸依賴性菌株。

圖2 菌株C1生產(chǎn)的γ-PGA水解液氨基酸分析圖譜Fig.2 Amino acids analysis of hydrolysate of γ-PGA produced by C1

不同的菌株合成γ-PGA的能力不同，這不僅和菌株本身的遺傳特性有關(guān)，也與培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分有關(guān)。Goto等［13］發(fā)現(xiàn) B.subtilis IFO3335在含有檸檬酸和谷氨酸的培養(yǎng)基中γ-PGA的產(chǎn)量可達到9.6 g/L。 Ashiuchi 等［9］發(fā) 現(xiàn) B.subtilis subsp.chungkookjang在含有20 g/L谷氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，γ-PGA的產(chǎn)量可達到13.5 mg/mL。惠明等［20］發(fā)現(xiàn)檸檬酸、甘油和(NH4)2SO4是 Bacillus sp.B53合成γ-PGA比較適宜的C源和N源，前體物質(zhì)L-谷氨酸的存在是聚谷氨酸高產(chǎn)所必需的;Bacillus sp.B53在優(yōu)化培養(yǎng)基上產(chǎn)生γ-PGA 19.12 g/L，比原始基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基上的8.87 g/L提高了115.56%。徐虹等［21］從土壤中篩選出 1株高產(chǎn)γ-PGA的菌株B.subtilis NX2，其合成γ-PGA的產(chǎn)量可高達41 g/L，但是這種高產(chǎn)量是通過添加70 g/L γ-PGA的前體物質(zhì)谷氨酸實現(xiàn)的，發(fā)酵成本較高，但適宜大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)需求。篩選的菌株C1在含有10 g/L的谷氨酸的培養(yǎng)基中，通過搖瓶發(fā)酵γ-PGA的產(chǎn)量可達到18.4 g/L，成本低且底物轉(zhuǎn)化率較高，因此具有一定的開發(fā)利用潛力，但后續(xù)研究還需確定菌株C1能否適應(yīng)高濃度底物的發(fā)酵條件且仍具有較高的底物轉(zhuǎn)化效率。

2.3 γ-PGA相對分子質(zhì)量的測定

利用凝膠滲透色譜法(GPC)檢測菌株C1發(fā)酵生產(chǎn)的γ-PGA的相對分子質(zhì)量大小，γ-PGA的出峰時間為13.787 min(圖3)。通過相對分子質(zhì)量計算方程計算菌株C1生產(chǎn)的γ-PGA的相對分子質(zhì)量為1.8×106。γ-PGA相對分子質(zhì)量分布較廣，通常在1.0×104～1.0范圍內(nèi)［22］。不同的菌株合成的γ-PGA相對分子質(zhì)量不同，相同的菌株在不同的培養(yǎng)基中甚至在不同的生長階段相對分子質(zhì)量也不同。通常相對分子質(zhì)量大于4.0×105的γ-PGA就可應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域，其吸水保濕性能較好［23］，菌株C1合成的γ-PGA相對分子質(zhì)量為1.8×106，聚合度高，應(yīng)用前景較好。γ-PGA具有多種應(yīng)用的潛力［1］，有報道稱，決定γ-PGA實際應(yīng)用能力的一個關(guān)鍵特點是其相對分子質(zhì)量大?。?4］。然而，到目前為止，γ-PGA的功能和其結(jié)構(gòu)特點(相對分子質(zhì)量、D/L-谷氨酸比例等)的關(guān)系及作用機制還沒有被報道［25］。因此，有關(guān)此方向的研究仍需要更深層次的開展以更大程度地對γ-PGA的應(yīng)用進行開發(fā)。

圖3 菌株C1發(fā)酵生產(chǎn)的γ-PGA的GPC檢測圖譜Fig.3 Molecular weight of γ-PGA produced by C1 detected by GPC

2.4 菌株C1的鑒定

2.4.1 菌株C1的形態(tài)鑒定

圖4為菌株C1的顯微鏡及平板拉絲照片。由圖4可知:菌株C1在固體篩選培養(yǎng)基上菌落為圓形，生長中前期，菌落表面光滑發(fā)亮，邊緣整齊，中間突起，無色或略帶黃色，半透明到透明，且黏度較大;生長后期，菌落表面變得不再光滑，且沒有亮度也不再透明，菌落邊緣開始出現(xiàn)褶皺，菌落不再突起。經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn)菌株C1為革蘭氏陽性，細胞形狀為桿狀，產(chǎn)芽胞，且形成莢膜。

2.4.2 生理生化結(jié)果

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［11］，對菌株C1的部分生理生化實驗進行了研究，結(jié)果見表3。

圖4 菌株C1的顯微鏡及平板拉絲效果Fig.4 Morphology of strain C1 on the plate and under the microscope

表3 菌株C1生理生化實驗結(jié)果Table 3 Results of physiological and biochemistry experiments of C1

由表3可知菌株C1具有以下特性:葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，能利用淀粉、蔗糖、果糖、甘露醇和木糖，好氧，H2O2陽性，石蕊牛奶還原陽性，硝酸鹽還原陽性，明膠液化，分解酪素，不分解酪氨酸等。與芽胞桿菌的生理生化描述一致。結(jié)合菌株C1的平板上形態(tài)特征及顯微鏡下形態(tài)特征確定菌株C1為芽胞桿菌。

2.5 16S rDNA鑒定

提取菌株C1的基因組DNA，經(jīng)PCR擴增后回收測序，所測菌株C1的16S rDNA核苷酸序列長度為1 419 bp，序列送GenBank做BLAST分析。根據(jù)GenBank提供的基因序列，依據(jù)16S rDNA序列利用MEGA軟件構(gòu)建進化樹進行分析(圖5)。由圖5可知:與菌株 C1同源性最高菌株的是 Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23350，同源性為100%。因此，將菌株C1命名為Bacillus amyloliquefaciens C1，并將其16S rDNA基因序列上傳到NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為JQ965939。

圖5 菌株C1基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on partial 16S rDNA sequences of C1 and reference strains

2.6 菌株合成γ-PGA功能基因的PCR擴增

根據(jù)文獻報道，設(shè)計 γ-PGA合成基因 pgsA、pgsB和pgsC的引物并對菌株C1的基因組進行PCR擴增，可以獲得同文獻報道片段大小一致的PCR條帶，結(jié)果見圖6。由圖6可知:通過測序驗證，pgsA、pgsB和pgsC的片段大小分別為 1 143、1 182和450 bp。從自然界中篩選的野生菌株合成γ-PGA的能力有限，往往不能滿足工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的需要，因此，有時需要對篩選的野生菌株發(fā)酵條件進行優(yōu)化或者對其進行改造。Yooh等［26］利用分批補料發(fā)酵試驗使得地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)合成γ-PGA的能力達到35 g/L。徐艷萍等［27］對地衣芽胞桿菌進行亞硝基胍和60Co誘變，獲得1株γ-PGA的高產(chǎn)菌株C9，γ-PGA質(zhì)量濃度由9.44 g/L提高到19.76 g/L，提高了109%。隨著分子生物學技術(shù)在工業(yè)發(fā)酵微生物改造方面的應(yīng)用，基因工程修飾將會更直接高效地提高目標菌株γ-PGA的發(fā)酵產(chǎn)量，本實驗室將繼續(xù)進行該方面的研究。

圖6 pgsA、pgsB和pgsC基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜Fig.6 Electrophoresis images of PCR products of pgsA，pgsB，and pgsC on agrose

3 結(jié)論

從土壤中篩選分離到1株產(chǎn)γ-PGA的細菌C1，在30℃、170 r/min條件下液體搖瓶發(fā)酵48 h，γ-PGA產(chǎn)量為18.4 g/L，相對分子質(zhì)量為1.8×106。菌株C1菌落黏稠，為革蘭氏陽性，產(chǎn)芽胞，能利用葡萄糖、蔗糖發(fā)酵，水解淀粉，H2O2酶陽性，產(chǎn)吲哚等，經(jīng)16S rDNA鑒定為1株解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，并擁有γ-PGA合成的相關(guān)功能基因pgsA、pgsB和pgsC。綜上所述，分離篩選的菌株C1生產(chǎn)γ-PGA產(chǎn)量高、相對分子質(zhì)量大，且遺傳特性穩(wěn)定，具有較為廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。在后期工作中，還需確定菌株C1能否適應(yīng)高濃度底物的發(fā)酵條件且仍具有較高的底物轉(zhuǎn)化效率，并對該菌株進行基因工程改造，以提高γ-PGA的發(fā)酵產(chǎn)量。

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