趙權(quán)宇，于水燕，張保國(guó)，史吉平

(中國(guó)科學(xué)院 上海高等研究院，上海 201210)

CO2減排是世界范圍內(nèi)的一個(gè)重要課題，微藻可以通過(guò)光合作用固定CO2，再將CO2轉(zhuǎn)化成生物質(zhì)。部分微藻在缺氮等脅迫條件下能富集油脂，可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成生物柴油，是非常有潛力的生物燃料［1］。微藻生物煉制的產(chǎn)業(yè)鏈上包括多個(gè)技術(shù)難點(diǎn)。其中，藻種選育、大規(guī)模培養(yǎng)和藻水分離等都有了大量研究積累。目前，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益仍是微藻生物柴油產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵，和乙醇發(fā)酵過(guò)程耦聯(lián)［2］或聯(lián)產(chǎn)高附加值產(chǎn)品［3］都是可行的模式。

蝦青素是具有超強(qiáng)抗氧化性的脂溶性色素，可以開(kāi)發(fā)成保健品、藥品或食品添加劑等，市場(chǎng)潛力巨大。紅法夫酵母和雨生紅球藻是主要的蝦青素生產(chǎn)模式體系［4－6］。雖然小球藻中蝦青素的含量低［7－9］，但是規(guī)?；囵B(yǎng)小球藻提取油脂后聯(lián)產(chǎn)的蝦青素也有一定規(guī)模。

基元模式是代謝網(wǎng)絡(luò)中從底物到產(chǎn)物的可能途徑或內(nèi)部循環(huán)［10］。通過(guò)基元模式分析，可以探討生物代謝調(diào)控機(jī)制或進(jìn)行菌株改造等［11］。本文中筆者首先構(gòu)建小球藻的代謝網(wǎng)絡(luò)模型，通過(guò)基元模式分析，考察小球藻在正常培養(yǎng)和缺氮培養(yǎng)條件下油脂代謝和蝦青素的合成。

1 計(jì)算部分

1.1 模型構(gòu)建

在文獻(xiàn)構(gòu)建的小球藻代謝網(wǎng)絡(luò)模型基礎(chǔ)上［12－14］，增加了蝦青素合成途徑，并完善了三羧酸循環(huán)(TCA)途徑的代謝反應(yīng)。一般來(lái)說(shuō)，代謝網(wǎng)絡(luò)中包含一個(gè)生物質(zhì)合成反應(yīng)，該反應(yīng)由蛋白質(zhì)、糖、脂類和核酸等組成，以及相關(guān)能量和輔因子代謝計(jì)算得到。生物質(zhì)合成反應(yīng)的系數(shù)會(huì)隨著培養(yǎng)條件的不同而變化，比如正常培養(yǎng)(+N)和缺氮培養(yǎng)(－N)等［14］，這樣計(jì)算的基元模式就會(huì)不同。為了便于考察小球藻正常培養(yǎng)和缺氮培養(yǎng)的代謝情況，參照文獻(xiàn)［15］的方法，取消了生物質(zhì)合成總反應(yīng)，為生物質(zhì)合成反應(yīng)中的若干前體物質(zhì)設(shè)定了相應(yīng)的外部代謝物。構(gòu)建的小球藻代謝網(wǎng)絡(luò)模型包括生化反應(yīng)29個(gè)，底物和產(chǎn)物跨膜傳遞以及生物質(zhì)前體生成過(guò)程14個(gè)，詳見(jiàn)附表。

1.2 胞內(nèi)代謝通量的估算方法

胞內(nèi)代謝通量分布反映細(xì)胞的代謝表型，可以深入了解代謝調(diào)控機(jī)制。同位素標(biāo)記代謝通量測(cè)定能準(zhǔn)確得到胞內(nèi)代謝分布，但是一般集中在中心碳代謝。為了在更大代謝網(wǎng)絡(luò)模型上得到代謝流量分布，可以集成同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)有約束代謝通量分析獲得代謝通量分布［16－17］。代謝通量可以分解在基元模式上。通過(guò)基于基元模式的算法進(jìn)行胞內(nèi)代謝通量的估算也是可行的。首先由CellNetAnalyzer(V6.0)［18］計(jì)算基元模式，見(jiàn)式(1)。

式中:E為基元模式矩陣，λ為基元模式系數(shù)，v為代謝通量。筆者前期開(kāi)發(fā)了基于基元模式的算法，可以集成同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過(guò)最大熵原理估算胞內(nèi)代謝分布［19-20］。具體算法見(jiàn)式(2)～(5)。

通過(guò)平均預(yù)測(cè)偏差比較預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值的差異，見(jiàn)式(6)。

式中:vexp為實(shí)驗(yàn)值;vestimated為代謝通量的預(yù)測(cè)值;ne為實(shí)驗(yàn)測(cè)定的代謝通量數(shù)。

1.3 基元模式概率的計(jì)算

筆者定義了基元模式概率pi［19］。第 i條基元模式概率pi由基元模式系數(shù)λi計(jì)算得到，反映了每條基元模式對(duì)代謝表型的貢獻(xiàn)。

式中:vsubstrateuptake為底物攝取速率;esubstrateuptake，i為基元模式矩陣中第i條基元模式中底物攝取反應(yīng)對(duì)應(yīng)的系數(shù)。所有基元模式概率加合后為1。

1.4 油脂和蝦青素合成效率的計(jì)算

基元模式的一個(gè)作用是分析代謝產(chǎn)物的理論合成效率。一般來(lái)說(shuō)，除了內(nèi)部循環(huán)外，每條基元模式都包括底物攝取和產(chǎn)物合成反應(yīng)。由底物攝取和產(chǎn)物合成的基元模式系數(shù)即可計(jì)算該基元模式中的產(chǎn)物合成效率，見(jiàn)式(8)。

式中:Yi，product為第i條基元模式的某產(chǎn)物的合成效率;λi，product formation和 λi，product formation分別為第 i條基元模式中某產(chǎn)物的合成和底物攝取的基元模式系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 胞內(nèi)代謝通量的估算

根據(jù)文獻(xiàn)［13］報(bào)道的小球藻代謝通量數(shù)據(jù)，由式(2)～式(4)計(jì)算基元模式系數(shù)，再由式(5)估算胞內(nèi)代謝通量分布，結(jié)果見(jiàn)圖1。利用式(6)計(jì)算正常和缺氮培養(yǎng)條件下的代謝通量平均預(yù)測(cè)偏差均為0.05，蝦青素的合成通量分別為0.38和0.35。

圖1 小球藻正常培養(yǎng)(+N)和缺氮培養(yǎng)(－N)條件下胞內(nèi)代謝通量估算值與實(shí)驗(yàn)值［13］比較Fig.1 Comparison of estimated flux distributions and experimental data［13］ of Chlorella sp under normal condition and nitrogen-limited conditions

2.2 基元模式概率的計(jì)算

由式(7)計(jì)算小球藻正常培養(yǎng)和缺氮培養(yǎng)的基元模式概率，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 小球藻正常培養(yǎng)和缺氮培養(yǎng)條件下基元模式概率Fig.2 Probabilities of elementary modes of Chlorella sp.under normal and nitrogen limited conditions

由圖2可見(jiàn):在正常培養(yǎng)和缺氮培養(yǎng)條件下，第603、77、309和61條基元模式對(duì)代謝表型的貢獻(xiàn)都是較大的。這4條基元模式在正常培養(yǎng)條件下的基元模式概率分別為26.14%、19.18%、8.84%和6.79%，總貢獻(xiàn)為60.90%;在缺氮培養(yǎng)條件下的貢獻(xiàn)為27.39%、27.88%、11.05%和11.21%，總貢獻(xiàn)為77.53%。

第603條基元模式(EM603)包含糖酵解(EMP)和TCA途徑(圖3(a))。第77條基元模式(EM77)是從葡萄糖到生物質(zhì)中乙酰輔酶A的合成(圖3(b))。乙酰輔酶A是氨基酸和油脂合成的前體化合物。第309條基元模式(EM309)表示的是從葡萄糖到葡萄糖-6-磷酸進(jìn)入磷酸戊糖途徑，經(jīng)糖酵解產(chǎn)生丙酮酸再進(jìn)入TCA途徑(圖3(c))。第61條基元模式(EM61)是從葡萄糖經(jīng)磷酸戊糖途徑和糖酵解到生物質(zhì)中乙酰輔酶A的合成(圖3(d))。

這4條基元模式都包含能量代謝反應(yīng)，說(shuō)明能量代謝對(duì)小球藻代謝表型有重要作用。缺氮條件下，包含乙酰輔酶 A合成的基元模式(EM77和EM61)的貢獻(xiàn)顯著增加，對(duì)應(yīng)的代謝表型表現(xiàn)為油脂含量的增加。概率最大的4條基元模式中并不包含蝦青素的合成反應(yīng)。在正常和缺氮培養(yǎng)條件下，含有蝦青素合成的基元模式概率(pi)，最大基元模式如圖4所示。由圖4可知:該途徑不包含其他生物質(zhì)前體的合成，這也是合成蝦青素效率最高的途徑。EMP途徑有蝦青素合成的2個(gè)重要前體，而從琥珀酸到富馬酸的反應(yīng)包含F(xiàn)AD等輔酶，這些輔酶也參與到蝦青素的合成，因此這條基元模式包含了TCA途徑。

2.3 油脂與蝦青素合成效率

由式(8)計(jì)算乙酰輔酶A流向生物質(zhì)合成(附表中反應(yīng)R30)或蝦青素合成(附表中反應(yīng)R40)的理論產(chǎn)率。小球藻在正常和缺氮培養(yǎng)條件下的實(shí)際產(chǎn)率也標(biāo)注在圖5中。油脂產(chǎn)率和蝦青素產(chǎn)率是競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。由圖4可知:在丙酮酸(PYR)節(jié)點(diǎn)，如果向蝦青素的代謝通量增加，則向乙酰輔酶A的通量將減少，直接影響油脂產(chǎn)率。由圖5可知，小球藻蝦青素的最大理論產(chǎn)率為11.27%。氮脅迫(－N)使得油脂產(chǎn)率提高，但是蝦青素含量也略有降低。如果要達(dá)到油脂和蝦青素合成的最大化，還有很大的優(yōu)化空間。很多手段可以調(diào)控蝦青素的合成，異養(yǎng)即使無(wú)光也可以合成蝦青素［9］。營(yíng)養(yǎng)、鹽度、鐵離子、光照和活性氧等也會(huì)調(diào)控蝦青素的累積［7－9，21－22］，蝦青素合成和油脂積累的協(xié)調(diào)優(yōu)化還有待研究。

圖3 小球藻正常和缺氮培養(yǎng)條件下主要基元模式:EM603(a)、EM77(b)、EM309(c)和EM61(d)Fig.3 Dominant elementary modes of Chlorella sp.under normal and nitrogen limited conditions:EM603(a)，EM77(b)，EM309(c)and EM61(d)

3 結(jié)論

1)建立了包含蝦青素合成途徑的小球藻代謝網(wǎng)絡(luò)模型，并計(jì)算了其基元模式;集成同位素標(biāo)記代謝通量數(shù)據(jù)，估算了胞內(nèi)代謝通量分布。正常培養(yǎng)和缺氮培養(yǎng)下蝦青素的代謝通量分別為0.38和0.35。

2)應(yīng)用最大熵算法求取了正常和缺氮培養(yǎng)條件下小球藻的基元模式概率。在這2種培養(yǎng)條件下，4條基元模式對(duì)代謝表型的貢獻(xiàn)分別為60.95%和77.53%。蝦青素的最大理論產(chǎn)率為11.27%，而2種培養(yǎng)條件下的實(shí)際產(chǎn)量均低于0.4%。

圖4 蝦青素的最有效基元模式ig.4 Most efficient elementary mode for astaxanthin production

圖5 小球藻蝦青素產(chǎn)率與生物質(zhì)中乙酰輔酶A產(chǎn)率的關(guān)系Fig.5 Relations between astaxanthin yield and ACCOA yield in biomass

附表:小球藻代謝網(wǎng)絡(luò)模型(EXT:外部代謝物;==＞不可逆反應(yīng);＜==＞可逆反應(yīng))

R15:ACCOA+ICIT+NAD==＞NADH+FUM+MAL R16:MAL+NADP==＞CO2+NADPH+PYR R17:PEP+CO2==＞OAA R18:OAA+ATP==＞ADP+PEP+CO2 R19:G6P+NADP==＞D6PGL+NADPH R20:D6PGL+NADP==＞P5P+CO2+NADPH R21:P5P+E4P＜==＞F6P+GAP R22:2 P5P＜==＞S7P+GAP R23:S7P+GAP＜==＞F6P+E4P R24:GAP+ATP+NADPH+PYR==＞ADP+IPP+NADP+CO2 R25:NADH+8 IPP+FADH2==＞Astaxanthin+NAD+FAD R26:NAD+NADPH==＞NADH+NADP R27:1.5 ADP+FADH2+0.5 O2==＞1.5 ATP+FAD R28:ATP==＞ADP R29:ADP+NADH+0.5 O2==＞NAD+ATP R30:ACCOA==＞ACCOAEXT R31:AKG==＞AKGEXT R32:E4P==＞E4PEXT R33:G6P==＞G6PEXT R34:GAP==＞GAPEXT R35:OAA==＞OAAEXT R36:3PG==＞3PGEXT R37:P5P==＞P5PEXT R38:PEP==＞PEPEXT R39:PYR==＞PYREXT R40:Astaxanthin==＞AstaxanthinEXT R41:GLCEXT==＞GLC R42:O2＜==＞O2EXT R43:CO2＜==＞CO2EXT

［1］ 楊忠華，李方芳，曹亞飛，等.利用微藻固定CO2實(shí)現(xiàn)碳減排研究進(jìn)展［J］.生物加工過(guò)程，2012，10(1):70-76.

［2］ 廖莎，姚長(zhǎng)洪，薛松，等.利用乙醇發(fā)酵副產(chǎn)CO2培養(yǎng)富含淀粉亞心型四爿藻作為其補(bǔ)充原料［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2011，27(9):1292-1298.

［3］ Liu J，Huang J，Jiang Y，et al.Molasses-based growth and production of oil and astaxanthin by Chlorella zofingiensis［J］.Bioresour Technol，2012，107:393-398.

［4］ 鄭裕國(guó)，沈寅初.微生物發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素［J］.生物工程進(jìn)展，2002，22(2):19-22.

［5］ 董慶霖，趙學(xué)明，邢向英，等.碳和氮代謝被抑制誘導(dǎo)雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素的合成［J］.化學(xué)工程，2006，34(12):48-49.

［6］ 董慶霖，趙學(xué)明，馬紅武，等.生物技術(shù)生產(chǎn)蝦青素研究的最新進(jìn)展［J］.生物加工過(guò)程，2004，2(2):18-14.

［7］ Ip P F，Chen F.Employment of reactive oxygen species to enhance astaxanthin formation in Chlorella zofingiensisin heterotrophic culture［J］.Process Biochem，2005，40(11):3491-3496.

［8］ Ip P F，Chen F.Peroxynitrite and nitryl chloride enhance astaxanthin production by the green microalga Chlorella zofingiensis in heterotrophic culture［J］.Process Biochem，2005，40(11):3595-3599.

［9］ Ip P F，Chen F.Production of astaxanthin by the green microalga Chlorella zofingiensis in the dark［J］.Process Biochem，2005，40(2):733-738.

［10］ Kurata H，Zhao Q，Okuda R，et al.Integration of enzyme activities into metabolic flux distributions by elementary mode analysis［J］.BMC Syst Biol，2007，1:31.

［11］ Zhao Q，Kurata H.Genetic modification of flux for flux prediction of mutants［J］.Bioinformatics，2009，25(13):1702-1708.

［12］ Xiong W，Gao C，Yan D，et al.Double CO2fixation in photosynthesis-fermentation model enhances algal lipid synthesis for biodiesel production［J］.Bioresour Technol，2010，101(7):2287-2293.

［13］ Xiong W，Liu L，Wu C，et al.13C-tracer and gas chromatographymass spectrometry analyses reveal metabolic flux distribution in theoleaginous microalga Chlorella protothecoides［J］. Plant Physiol，2010，154(2):1001-1011.

［14］ Yang C，Hua Q，Shimizu K.Energetics and carbon metabolism duringgrowth ofmicroalgalcellsunderphotoautotrophic，mixotrophic and cyclic light-autotrophic/dark-heterotrophic conditions［J］.Biochem Eng J，2000，6(2):87-102.

［15］ Burgard A P，Maranas C D.Optimization-based framework for inferring and testing hypothesized metabolic objective functions［J］.Biotechnol Bioeng，2003，82(6):670-677.

［16］ 劉立明，劉婷，鄒偉.基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型的約束算法及其應(yīng)用［J］.生物加工過(guò)程，2012，10(6):70-77.

［17］ 王宏麗，梁金鐘.添加物對(duì)枯草芽胞桿菌γ-聚谷氨酸合成代謝的影響［J］.生物加工過(guò)程，2010，8(1):45-49.

［18］ Klamt S，Saez-Rodriguez J，Gilles E D.Structural and functional analysis of cellular networks with CellNetAnalyzer［J］.BMC Syst Biol，2007，1:2.

［19］ Zhao Q Y，Kurata H.Maximum entropy decomposition of flux distribution at steady state to elementary modes［J］.J Biosci Bioeng，2009，107(1):84-89.

［20］ Zhao Q Y，Kurata H.Use of maximum entropy principle with Lagrange multipliers extends the feasibility of elementary mode analysis［J］.J Biosci Bioeng，2010，110(2):254-261.

［21］ Wang Y，Liu Z，Qin S.Effects of iron on fatty acid and astaxanthin accumulation in mixotrophic Chromochloris zofingiensis［J］.Biotechnol Lett，2013，35(3):351-357.

［22］ Campenni L，Nobre B P，Santos C A，et al.Carotenoid and lipid production by the autotrophic microalga Chlorella protothecoides under nutritional，salinity，and luminosity stress conditions［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2013，97(3):1383-1393.