唐亮，王燕，陳碧峰

1.長沙醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，湖南 長沙 410219；2.香港中文大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)院，香港

Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）是免疫過程中重要的病原體識別受體，在天然免疫和獲得性免疫過程中起重要作用[1]。TLR9屬于TLR家族，定位于內(nèi)體膜上，在序列結(jié)構(gòu)上具有高度的保守性[2]。TLR9廣泛表達于機體各處組織，且具有組織特異性。在細胞水平上，TLR9主要表達于抗原提呈細胞，T細胞、單核細胞等中的TLR9表達量很少。不同動物、不同細胞群的表達水平差異較大。研究表明，免疫細胞通過TLR9識別含CpG基序的寡聚脫氧核苷酸（CpG-ODN）[3]。TLR9表達失衡可能導(dǎo)致動物感染性疾病[4]、自身免疫性疾病[5]及腫瘤[6]等。

表觀遺傳學(xué)研究提示CpG島甲基化在基因表達調(diào)控中的重要作用，尤其是啟動子區(qū)序列甲基化狀態(tài)對基因的表達影響深遠。進一步探討TLR9基因表達調(diào)控，有利于深入了解其在疾病發(fā)生中的生物學(xué)作用。我們利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測了TLR9基因啟動子區(qū)，獲得了基因啟動子區(qū)的甲基化區(qū)域及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位，為進一步研究TLR9基因在疾病患者中的基因調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索人（HOMO）和小鼠（MUS）TLR9基因，ID分別為54106和81897，獲得Genbank格式文件。

在線核算數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）；序 列 對 比 BLASTN（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）；啟動子在線分析軟件［Promoter 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）；Network Promot?er Prediction（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promot?er.html）；Promoter SCAN（http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/）］；轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測軟件（P-Match 1.0，http://www.gene-regulation.com/pub/programs.ht?ml#match）；兩序列間保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位預(yù)測 軟 件（Consite，http://asp.ii.uib.no:8090/cgi-bin/CONSITE/consite/）；CpG 島預(yù)測軟件（http://cpgis?lands.usc.edu/）。

1.2 方法

獲得人和小鼠TLR9基因同源序列，確定TLR9基因啟動子區(qū)，利用上述軟件預(yù)測TLR9基因啟動子。利用P-Match 1.0程序，核心序列相似性設(shè)定為0.80，矩陣相似性設(shè)定為 0.85，輸入 TLR9 基因上游3000 bp序列，搜索轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位，獲得啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。利用Consite程序搜索人與小鼠TLR9基因保守區(qū)，排除假陽性結(jié)合部位。將TLR9啟動子區(qū)域序列導(dǎo)入CpG島在線軟件進行甲基化預(yù)測。

2 結(jié)果

2.1 人和小鼠TLR9基因啟動子定位

人TLR9基因定位于染色體3p21.3，有2個外顯子、1個內(nèi)含子。轉(zhuǎn)錄mRNA的ID為NT_022517，跨越5084 bp。小鼠TLR9基因定位于染色體9F1;9，轉(zhuǎn)錄mRNA的ID為NM_031178.2，跨越4279 bp。

2.2 TLR9基因啟動子預(yù)測結(jié)果

通過檢索GenBank數(shù)據(jù)庫，對人TLR9基因第一外顯子上游3000 bp序列采用3種軟件預(yù)測分析，得出潛在的啟動子結(jié)構(gòu)（表1）。用3種不同的在線軟件預(yù)測的TLR9基因啟動子區(qū)域有一定的差異。用Promoter Scan程序未預(yù)測到相應(yīng)的啟動子區(qū)域，提示可能該啟動子缺失保守序列TATA盒。

2.3 TLR9基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分析

采用P-Match 1.0程序，核心序列相似性設(shè)定為0.80，矩陣相似性設(shè)定為 0.85，輸入 TLR9 基因上游3000 bp序列，搜索庫中脊椎動物轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位數(shù)據(jù)庫，獲得啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點共1434個。利用足跡法，采用Consite程序分析人與小鼠TLR9基因保守區(qū)域，對比確定保守區(qū)域中共有的轉(zhuǎn)錄因子有23個（表2）。

2.4 啟動子CpG島預(yù)測結(jié)果

用CpG島預(yù)測軟件分析人TLR9基因啟動子，發(fā)現(xiàn)該序列存在長度為572 bp（798～1359 bp）的CpG島，（G+C）含量為 66.4%，CpG 觀測值/預(yù)測值為0.679。見圖1。

3 討論

啟動子是RNA聚合酶識別、結(jié)合并開始轉(zhuǎn)錄所必需的一段DNA序列。基因啟動子DNA的甲基化狀態(tài)及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順序決定了基因表達的時間、空間及數(shù)量等特性，也是基因表達調(diào)控的重要組成部分?，F(xiàn)階段采用實驗方法檢測基因啟動子CpG島和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的難度較大。基于生物信息學(xué)技術(shù)，采用預(yù)測軟件，以理論預(yù)測的方法可以有效、快速地獲得基因的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)。

然而，基于各種算法的在線預(yù)測軟件對啟動子區(qū)、CpG島及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的預(yù)測并不完全可靠。啟動子的預(yù)測算法有多種。Promoter 2.0是基于啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄信號，如TATA盒、CAAT盒、GC盒等位置和距離的一類算法的預(yù)測軟件，而Promoter Scan是基于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位分布密度與TATA盒的權(quán)重矩陣而開發(fā)的預(yù)測軟件。不同的算法有不同的預(yù)測結(jié)果，且存在假陽性，須綜合考慮。

在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的預(yù)測中，程序只能針對已知位點進行預(yù)測，對未知的、新的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點則無法分析。從人TLR9基因啟動子區(qū)預(yù)測到與小鼠同源的23個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，提示TLR9基因啟動子在進化上高度保守，為今后進行異種轉(zhuǎn)基因及相關(guān)實驗提供了參考。

表1 TLR9基因啟動子預(yù)測結(jié)果

表2 人TLR9基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測結(jié)果

圖1 人TLR9基因啟動子CpG島分析結(jié)果

在哺乳動物中，DNA甲基化位點主要發(fā)生在CpG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上[7]。CpG以散在和集聚（CpG島）兩種形式存在。DNA的甲基化不僅影響基因本身的表達，而且這種影響能夠遺傳下去。而TLR9基因啟動子區(qū)存在572 bp的CpG島，預(yù)示著此段基因序列可能與感染性疾病、自身免疫病及腫瘤等發(fā)生有關(guān)，但此結(jié)論需要進一步的實驗驗證。

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