劉瑞瑾，吳新榮

廣州軍區(qū) 廣州總醫(yī)院，廣東 廣州 510010

微小染色體維系蛋白3（minichromosome main?tenance 3，MCM3）作為MCM家族的重要一員，與生物體DNA復制過程密切相關。細胞周期過程中基因組的復制調控對生物體具有重大意義，在真核生物DNA起始復制點，預復制復合物（prereplication complex，pre-RC）的形成和破壞是調控染色體被“許可”進入 S 期的關鍵因子[1-3]。MCM（MCM2～MCM7）是組成pre-RC的蛋白之一，具有保持與維系微小染色體的功能，保證染色體進入復制狀態(tài)[4]。目前，對啤酒酵母和哺乳動物中MCM3的研究較多。MCM3在哺乳動物細胞中的表達相對穩(wěn)定，但在進入G0期和分化終止的組織中迅速消失，這些特點使其成為正常組織增殖細胞的標記之一[5-6]。雖然MCM3在正常的增殖細胞中表達，但在腫瘤細胞中，MCM3的表達水平相對高于正常組織。Ha等[7]確證，MCM3在幾種人類腫瘤中過度表達。MCM3作為一種細胞DNA復制過程的特許因子，可作為標記物直接反映細胞的增殖狀態(tài)，對于因細胞周期調節(jié)失常、失去控制后產生的不典型增生和腫瘤的診斷及預后都有非常重要的指導意義。斑馬魚具有產卵量高，胚胎體外發(fā)育、透明易于觀察，有較完善的胚胎和遺傳學操作技術，品系資源豐富等優(yōu)點，已被作為一種重要的模式生物廣泛應用于發(fā)育生物學、遺傳學、藥物學等方面的研究。通過序列比對和進化樹分析，發(fā)現(xiàn)斑馬魚的MCM3與小鼠、人高度同源。整胚原位雜交技術是研究斑馬魚發(fā)育相關基因的功能和表達模式的一種重要手段。我們通過整胚原位雜交方法分析了MCM3的mRNA在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程的表達情況，為深入研究這一基因的功能提供基礎依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

斑馬魚為Tubingen野生型；感受態(tài)大腸桿菌DH5α由本室保存；TRIzol RNA提取試劑盒購自In?vitrogen公司；PrimeScript RT-PCR試劑盒、Taq DNA聚合酶、DNA ladder、限制性內切酶及SP6 RNA聚合酶購自TaKaRa公司；Dig RNA Labeling Mix購自Roche公司；pGM-T克隆試劑盒、質粒提取試劑盒及DNA純化試劑盒購自TIANGEN公司；顯微操縱儀（Olympus SZX7）；臺式高速低溫離心機（Backman）；紫外/可見光分光光度計（DU530，Back?man）；PCR 擴增儀（PE9600）；凝膠成像分析系統(tǒng)（EDAS120，KODAK）；多功能恒溫恒壓恒流電泳系統(tǒng)（Pharmacia）；SPX生化培養(yǎng)箱。

1.2 PCR引物設計

在NCBI網(wǎng)站上查得MCM3的cDNA序列，用Primer Premier 5.0軟件設計正義引物（5'-TACGC?CAAGCAATGTGAG-3'）和 反 義 引 物（5'-ATAG?CAGTGCGGTCCATA-3'），擴增片段長508 bp，引物由華大基因公司合成。

1.3 總RNA提取

收集受精后24 h（24 hpf）時期的Tubingen野生型斑馬魚胚胎，脫膜后用TRIzol液溶解，按照TRIzol RNA提取試劑盒說明書操作，-70℃保存。

1.4 RT-PCR擴增

按照PrimeScript RT-PCR試劑盒說明書將總RNA反轉錄成cDNA；以此cDNA為模板進行擴增（95℃預變性5 min，95℃變性10 s，56℃退火15 s，72℃延伸60 s，72℃延伸3 min，35個循環(huán)），瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收擴增的目的基因。

1.5 PCR產物克隆

將回收純化的DNA片段連接到T easy載體上，42℃熱激法轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，經(jīng)氨芐西林抗性篩選重組質?？寺?，菌落PCR鑒定有目的基因的重組質粒送華大基因公司測序。

1.6 RNA探針合成及純化

將純化的MCM3重組質粒用ApaⅠ酶切線性化，異丙醇純化，經(jīng)體外SP6轉錄體系轉錄，同時加入地高辛（DIG）標記的寡核苷酸，轉錄得到DIG-XOX-1反義mRNA探針，-70℃保存。

1.7 斑馬魚整胚原位雜交

參照文獻[8]收集固定斑馬魚胚胎并進行整胚原位雜交，在解剖顯微鏡白場下觀察并拍照。

2 結果

2.1 小鼠、人和斑馬魚MCM3的同源性分析

根據(jù)已報道的斑馬魚、小鼠、人的MCM3氨基酸序列，用CLC Sequence Viewer 6.1軟件構建系統(tǒng)進化樹，結果發(fā)現(xiàn)斑馬魚的MCM3氨基酸序列與小鼠、人高度同源，表明斑馬魚MCM3的功能可能與人相近（圖1）。

2.2 RT-PCR擴增MCM3基因片段

RT-PCR擴增MCM3基因片段，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，在500 bp附近呈現(xiàn)單一條帶，大小與預期相符（圖2）。

2.3 斑馬魚整胚原位雜交

解剖鏡下觀察MCM3在斑馬魚胚胎不同時期的表達。胚胎受精后0～12 h，MCM3在增殖性區(qū)域泛表達，表明這一時期的胚胎細胞普遍快速增殖，受精后10和12 h，體節(jié)和神經(jīng)系統(tǒng)分別出現(xiàn)；受精后14～22 h，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、發(fā)育未成熟的眼部、體節(jié)及增殖性區(qū)域表達；受精后24 h，在血液、中樞神經(jīng)、翼板中腦、視覺蓋及增殖性區(qū)域表達，并呈現(xiàn)表達逐漸減弱，說明這時胚胎的細胞增殖速度已相對減慢；受精后48 h，在頭部及肛門增殖性區(qū)域表達（圖3）。

圖1 小鼠、人和斑馬魚MCM3系統(tǒng)進化樹圖譜

3 討論

圖2 MCM3基因片段的PCR擴增結果M：100 bp DNA ladder；1：MCM3基因片段的PCR擴增產物

真核生物DNA復制通過適當?shù)恼{節(jié)以確保染色體在一個細胞周期中復制一次。真核細胞DNA復制是由復制點開始的，起始復制涉及許多蛋白復合體。在G1期，起始復制復合體上結合有起始識別復合體（origin recognition complex，ORC），其作用就像一個停泊點，供其他調節(jié)因子停靠，從而使染色體被“許可”進入S期。CDC6和CDT1是結合在ORC上的調節(jié)因子，其功能是促進由6個亞單位構成的MCM復合體和其他一些蛋白結合到ORC，形成pre-RC。MCM具有保持與維系微小染色體的功能，而ORC、CDC6和MCM在pre-RC的聚合保證了染色體進入復制狀態(tài)[9]。

斑馬魚早期發(fā)育過程中細胞快速分裂和增殖，受精后約50 min完成第一次有絲分裂，之后約每間隔15 min分裂一次。以上研究表明，MCM3的表達與胚胎細胞的增殖呈明顯的相關性。作為一種在細胞DNA復制過程中的特許因子，MCM3在斑馬魚體內可被選為標記物，直接反映細胞的增殖狀態(tài)。

圖3 斑馬魚MCM3基因的原位雜交表達圖譜

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