蔣東，唐銀琳，陶晨陳，吳耀生

廣西醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣西 南寧 530021

萜類化合物是一類以異戊二烯為結(jié)構(gòu)單元的天然烴類化合物，分布廣、種類多、結(jié)構(gòu)多樣，是重要的植物初生代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物，在植物的生長發(fā)育、自身免疫和防御反應(yīng)中起重要作用，同時也廣泛應(yīng)用于工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域[1]。絞股藍(lán)、三七、羅漢果等中草藥的主要活性物質(zhì)為萜類化合物。法呢基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophaophate synthase，F(xiàn)PS，EC2.5.1.10）是一種異戊烯基轉(zhuǎn)移酶，是類異戊二烯途徑的一個關(guān)鍵酶，催化五碳原子的異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）以1-4頭尾連續(xù)縮合反應(yīng)，形成15碳的法呢基焦磷酸（FPP）[2]，F(xiàn)PP是植物體內(nèi)許多萜類物質(zhì)合成的前體。目前已從羅漢果、三七、積雪草、青蒿等40多種植物中分離并克隆了FPS的cDNA序列。絞股藍(lán)以三萜皂苷為主要有效成分，研究其生物合成通路中的關(guān)鍵酶，是改變或調(diào)控其三萜皂苷合成通路，以提高有效成分含量和藥用價值的重要環(huán)節(jié)。

絞股藍(lán)（Gynostemma pentaphyllum Thunb.Ma?kin）為葫蘆科絞股藍(lán)屬植物，又名遍地生根、公羅鍋底、七葉膽等，始載于《救荒本草》，《本草綱目》、《植物名實(shí)圖考》、《實(shí)用中草藥手冊》中均有記載。絞股藍(lán)全草入藥，具有抗腫瘤、降血脂、抗衰老、護(hù)肝、增強(qiáng)免疫等作用[3]。目前對絞股藍(lán)的研究主要在有效成分的分離提取及其藥理作用方面。絞股藍(lán)三萜合成通路及相關(guān)酶的基因克隆、分子進(jìn)化等方面也有一些報道，如絞股藍(lán)鯊烯合酶（SS）及鯊烯環(huán)氧酶（SE）[4]。絞股藍(lán)具有較強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性，自然分布于我國秦嶺和長江以南地區(qū)，廣西大部分地區(qū)都有分布，資源豐富。因此，對其進(jìn)行系統(tǒng)研究，對我區(qū)絞股藍(lán)資源的合理利用和開發(fā)具有重要意義。

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等領(lǐng)域的興起，以mRNA為基礎(chǔ)的研究越來越受到關(guān)注，但mRNA在體外穩(wěn)定性差，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA是一種有效的解決方法。cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（rapid amplifi?catiion of cDNA ends，RACE）是一種始于mRNA的3'或5'端，最終獲得目的基因全長cDNA的分子生物學(xué)技術(shù)[5]，已成功地應(yīng)用于植物基因克隆研究。如蔣軍富等用RACE技術(shù)克隆到絞股藍(lán)SS及SE基因[4]，陳莉等用RACE技術(shù)從三七中克隆出FPS基因[6]，邢朝斌等通過RACE技術(shù)克隆出刺五加FPS基因[7]。RACE技術(shù)也可用來篩選cDNA文庫，魯國東等用RACE技術(shù)從已構(gòu)建的cDNA文庫中克隆了稻瘟病菌的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因[8]。RACE技術(shù)還可用來分離調(diào)控元件或選擇性剪接等特殊轉(zhuǎn)錄物[9]。

本課題組前期采用RACE技術(shù)對絞股藍(lán)生物合成關(guān)鍵酶SS、SE基因進(jìn)行了克隆和序列分析。為進(jìn)一步研究絞股藍(lán)三萜皂苷生物合成途徑及其可能的分子調(diào)控機(jī)制，我們繼續(xù)應(yīng)用RACE技術(shù)對絞股藍(lán)FPS基因進(jìn)行克隆及序列分析。

1 材料與方法

1.1 材料

絞股藍(lán)采自荔浦縣，種植在廣西醫(yī)科大學(xué)校園；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T載體、LA Taq DNA聚合酶限制性內(nèi)切酶、3'-Full RACE Core Set Ver 2.0和 5'-Full RACE 試劑盒等為 Ta?KaRa公司產(chǎn)品；柱式膠回收試劑盒及質(zhì)粒小量提取試劑盒為中國福際公司產(chǎn)品；DNA寡核苷酸引物由華大基因公司合成；其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 絞股藍(lán)總RNA的提取

參照蔣軍富等的異硫氰酸胍法[4]。

1.3 3'RACE PCR 克隆

絞股藍(lán)與羅漢果均為葫蘆科植物，其三萜生物合成通路相關(guān)酶的基因應(yīng)有較高的同源性。參照蒙姣榮[10]等有關(guān)羅漢果FPS基因的克隆及序列分析，設(shè)計(jì)擴(kuò)增絞股藍(lán)FPS的3'RACE PCR引物FPSS-1F和FPSS-3F，由華大基因公司合成。

以絞股藍(lán)總RNA為模板，加入3'RACE Adap?tor，按試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。反應(yīng)體系包括絞股藍(lán)總RNA 1 μL、3'RACE接頭1 μL、5×M-MLV緩沖液2 μL、dNTP 1 μL、RNase抑制劑 0.25 μL、反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV（RNase H-） 0.25 μL，用去除RNase的水補(bǔ)至總體積10 μL。42℃反轉(zhuǎn)錄60 min，70℃作用15 min，反應(yīng)產(chǎn)物用于巢式PCR。以反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA為模板，分別以FPSS-1F、FPSS-3F與3'RACE試劑盒中的3'RACE外引物、3'RACE內(nèi)引物為引物，按照3'-Full RACE Core Set Ver 2.0說明進(jìn)行3'RACE外側(cè)、內(nèi)側(cè)2輪巢式PCR擴(kuò)增反應(yīng)。第1輪PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性 3 min，然后以 94℃變性 30 s、55退火 30 s、72℃延伸1 min行20個循環(huán)，72℃延伸10 min。以第1輪PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第2輪巢式PCR。第2輪PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min，然后以94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min行30個循環(huán)，72℃延伸10 min。用瓊脂糖電泳判斷PCR產(chǎn)物。內(nèi)側(cè)PCR產(chǎn)物純化后，與pMD18-T連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在X-gal/IPTG/Amp LB瓊脂平板上挑取白色菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切及PCR鑒定，將陽性克隆送華大基因公司測序。

1.4 5'RACE PCR克隆

根據(jù)絞股藍(lán)FPS的3'RACE測序結(jié)果，用專業(yè)引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)5'RACE克隆所需特異引物。

用5'-Full RACE試劑盒對絞股藍(lán)RNA進(jìn)行去磷酸化處理、去“帽子”反應(yīng)及5'RACE接頭的連接，得到Ligated RNA，以Ligated RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液為模板，分別以FPSS-2R、FPSS-4R與5'RACE試劑盒中的外引物、內(nèi)引物為引物對進(jìn)行2輪巢式PCR反應(yīng)。第1輪PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min，然后以94℃變性30 s、55退火30 s、72℃延伸1 min行20個循環(huán)，72℃延伸10 min。以第1輪PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第2輪巢式PCR。第2輪PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min，然后以94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min行 25個循環(huán)，72℃延伸 10 min。5'RACE內(nèi)側(cè)PCR產(chǎn)物的純化及克隆參照3'RACE克隆操作進(jìn)行。

1.5 絞股藍(lán)FPS基因cDNA全長序列的拼接及生物信息學(xué)分析

利用 Vector NTI Suite 6.0軟件對 3'RACE 和5'RACE所得片段的測序結(jié)果進(jìn)行分析和拼接。利用DNAman軟件分析絞股藍(lán)FPS基因cDNA全長序列性質(zhì)，序列測定結(jié)果采用Blast進(jìn)行同源性搜索。用Mega5.0軟件對絞股藍(lán)和已報道的植物FPS氨基酸序列進(jìn)行相似性比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 擴(kuò)增絞股藍(lán)FPS的RACE PCR引物

2 結(jié)果

2.1 3'RACE和5'RACE克隆絞股藍(lán)FPS基因

3'RACE和5'RACE分別得到約1000和750 bp的特異條帶，參見圖1。

3'RACE PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒經(jīng)SacⅠ/SphⅠ雙酶切，得到2.6 kb的載體片段和約1 kb的目的片段；5'RACE PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后得到約750 bp的目的片段和2.6 kb的載體片段。與預(yù)測結(jié)果相符，見圖2。

2.2 PCR產(chǎn)物測序

測序結(jié)果表明，3'RACE和5'RACE產(chǎn)物片段長度分別為985和714 bp（序列略）。

2.3 絞股藍(lán)FPS基因cDNA全長核苷酸序列分析

根據(jù)3'RACE和5'RACE擴(kuò)增片段測序結(jié)果，用Vector NTI Suite 6.0軟件拼接得到絞股藍(lán)FPS基因全長序列。該基因全長1288 bp，翻譯起始位點(diǎn)為90堿基處，開放讀框編碼由342個氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白，其等電點(diǎn)為5.34，相對分子質(zhì)量為3.94×104。

圖1 3′RACE（A）、5′RACE（B）PCR擴(kuò)增FPS基因產(chǎn)物M：DL2000 DNA marker；1，2：3′RACE PCR產(chǎn)物；3，4：5′RACE PCR產(chǎn)物

圖2 SacⅠ/SphⅠ雙酶切重組質(zhì)粒

氨基酸序列分析表明，絞股藍(lán)FPS的氨基酸序列中含有非極性疏水性氨基酸（GAVLIFP）40.6%，極性中性氨基酸（WSYCMNQT）35.0%，酸性氨基酸（DE）12.3%，堿性氨基酸（KRH）11.4%。

絞股藍(lán)的FPS基因cDNA及推衍的氨基酸序列如圖3。

2.4 不同植物FPS基因序列比較及進(jìn)化樹分析

經(jīng)NCBI Blast，發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)FPS的氨基酸序列與已知植物FPS的同源性為91%～74%，核酸序列同源性為88%～78%。用Mega5.0軟件將得到的絞股藍(lán)FPS與植物來源的FPS的氨基酸序列（表2）進(jìn)行多重比對，構(gòu)建得到進(jìn)化樹（圖4）。

3 討論

圖3 絞股藍(lán)FPS cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

RACE技術(shù)是獲得cDNA全長的有效方法，廣泛應(yīng)用于全長基因cDNA的克隆。在RACE技術(shù)中，獲得基因3'端較容易，而采用TDT加尾法[11]獲得基因5'端則比較困難，往往需要根據(jù)實(shí)際情況摸索條件。我們采用TaKaRa公司的5'-Full RACE試劑盒，在對RNA進(jìn)行去磷酸化、去“帽子”、加5'RACE接頭后直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行巢式PCR，可以得到很好的5'RACE結(jié)果。但操作時間長，對RNA的完整性和穩(wěn)定性要求高，因此保證RNA的質(zhì)量和操作環(huán)境的清潔非常重要。

圖4 不同植物FPS氨基酸序列進(jìn)化樹

本研究克隆的絞股藍(lán)FPS基因與已報道的其他植物的FPS基因的編碼區(qū)基本一致，F(xiàn)PS有2個富含天冬氨酸（DDXXDD）的氨基酸序列保守區(qū)域［LIVM］［LIVM］XDDXXDXXXXRRG 和［LIVMFY］GXXFQ［LIVM］XDD［LIVMFY］X［DN］[7,12-13]，推測的絞股藍(lán) FPS肽鏈 90～104殘基（LVLDDIMDSSH?TRRG）和224～236殘基（MGTYFQVQDDYLD）與此完全相符。絞股藍(lán)FPS的跨膜區(qū)分析和亞細(xì)胞定位顯示其無跨膜結(jié)構(gòu)，定位于細(xì)胞質(zhì)中，這與其他植物FPS在細(xì)胞質(zhì)中合成前體蛋白后不進(jìn)入其他亞細(xì)胞器，而是留在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)翻譯后蛋白質(zhì)的加工成為成熟蛋白質(zhì)發(fā)揮催化作用而不與膜脂結(jié)合[1,13]的觀點(diǎn)相一致。進(jìn)化樹分析表明絞股藍(lán)FPS與羅漢果、黃瓜的親緣關(guān)系最近，這證實(shí)了葫蘆科植物FPS基因的同源性，與預(yù)期結(jié)果相符。同時還發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)、羅漢果、黃瓜與蘋果FPS的親緣關(guān)系也較近，但根據(jù)NCBI采納的植物分類表，葫蘆科屬于葫蘆目，蘋果則屬于薔薇目薔薇科，進(jìn)化上葫蘆科植物與薔薇科處于不同的分支，有可能是一個FPS基因進(jìn)化的分支點(diǎn)。

目前利用酶表達(dá)改變萜類物質(zhì)組成或量已成為改變作物及中草藥植物品質(zhì)的一種新手段[14]。在轉(zhuǎn)基因青蒿中過量表達(dá)青蒿的FPS基因，轉(zhuǎn)基因株系中青蒿素量有所提高[15]。也有研究表明，這一技術(shù)可提高在轉(zhuǎn)化薄荷FPS基因的烤煙中類胡蘿卜素及萜烯類香氣物質(zhì)的量，對提高煙葉香氣品質(zhì)具有促進(jìn)作用[16]。綜上，我們在前人的基礎(chǔ)上克隆了絞股藍(lán)FPS基因，并對其編碼的氨基酸進(jìn)行了理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)組成及生物信息學(xué)分析，以期為絞股藍(lán)FPS的表達(dá)研究及三萜皂苷合成通路分子進(jìn)化奠定基礎(chǔ)。目前絞股藍(lán)FPS的表達(dá)研究正在進(jìn)行中。

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表2 用于進(jìn)化分析的植物來源的FPS序列信息

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