申靜靜++廖玉才++李和平

摘要：以甘藍型油菜（Brassica napus L.）葉片為材料，分析了影響油菜葉片離體培養(yǎng)的關鍵因素——基因型、基本培養(yǎng)基、激素配比及外植體取材時間，優(yōu)化了油菜葉片組織培養(yǎng)體系。結果表明，

關鍵詞：油菜（Brassica napus L.）；葉片；組織培養(yǎng)

中圖分類號：S565.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）02-0447-03

The Optimization of Regeneration System of Rapeseed（Brassica napus L.） Leaf

SHEN Jing-jinga，LIAO Yu-caib，LI He-pinga

（a.Moleculer Biotechnology Laboratory of Triticeae Crops/College of Life Science and Technology； b.Moleculer Biotechnology Laboratory of Triticeae Crops/College of Plant Science and Technology， Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070， China）

Abstract： Using leaf as explants from Brassica napus and focusing on factors（genotype， basic media， the hormones combinations and seeding age of explants） affecting the leaves regeneration in vitro， an effective regeneration system was established. The results showed that MS+4 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA was best for shooting， with differentiation and regeneration rate of 75.2% and 28.1%， respectively 1/2 MS+1 mg/L IBA was best for rooting， with the rooting rate of 100%. The explants of different seeding age from the same genotype showed great difference of shooting differentiation and regeneration capability. The 22-day leaf of F4 cultivar was the best explant for tissue culture.

Key words： Brassica napus L.； leaf； tissue culture

油菜（Brassica napus L.）是我國主要的油料作物之一[1]。近年來，隨著高等植物轉基因技術的不斷發(fā)展和應用，油菜高頻率植株再生組織培養(yǎng)體系是進行外源基因遺傳轉化的基礎，因此，探討油菜離體培養(yǎng)中不定芽分化和成苗的影響因素具有重要意義。自1974年Kartha等[2]首次從甘藍型油菜的莖切段組織培養(yǎng)誘導分化獲得植株以來，花序軸[3]、帶柄子葉[4，5]、下胚軸[6，7]、葉片[8-10]和子葉[11，12]等外植體被成功應用于油菜離體誘導獲得再生植株。本研究主要以F4和T15油菜品系的子葉為外植體，篩選合適于組織培養(yǎng)的基因型；以F4第18、22天苗齡的葉片為外植體，進一步優(yōu)化了分化和生根培養(yǎng)基，建立了甘藍型油菜F4品系葉片的再生體系，為通過油菜葉綠體轉基因技術獲得優(yōu)良性狀的甘藍型油菜奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

油菜F4和T15品系由華中農業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室提供。

1.2 培養(yǎng)基

1.3 方法

1.3.1 種子的消毒與無菌苗的獲得 挑選種皮完好、飽滿的油菜種子，70%乙醇消毒2 min，無菌水沖洗1次，15% H2O2滅菌35 min，無菌水沖洗3次。將種子置于B5基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d。挑選長勢一致的健壯幼苗移至B5基本培養(yǎng)基中繼續(xù)生長。培養(yǎng)溫度25 ℃，光照強度為2 000 lx，16 h/8 h（光照/黑暗）。

1.3.2 愈傷組織的誘導及分化 挑選5～6 d的子葉，將子葉切成3 mm×3 mm大小，置于愈傷誘導培養(yǎng)基中。誘導培養(yǎng)8周后，轉分化培養(yǎng)，每2周繼代一次。誘導培養(yǎng)2 周時統(tǒng)計愈傷誘導率，分化培養(yǎng)4～6周時進行分化率和成苗率統(tǒng)計，試驗設3個重復。愈傷誘導率=產生愈傷組織的外植體數(shù)/接種的總外植體數(shù)×100%；分化率=至少分化出一個根或芽的外植體數(shù)/接種的總外植體數(shù)×100%；成苗率=至少出現(xiàn)一株苗的外植體數(shù)/接種的總外植體數(shù)×100%。

1.3.3 不同分化培養(yǎng)基對外植體芽、苗分化的影響 取苗齡18、22 d的葉片作為外植體，將葉片切成3 mm×3 mm大小，愈傷誘導培養(yǎng)基均為A，愈傷組織接種到不同分化培養(yǎng)基上。每2周繼代一次，分化培養(yǎng)4～6周時進行統(tǒng)計分化率，試驗設3個重復。試驗設有A與B①、A與B②、A與B③、A與B④、A與B⑤、A與B⑥、A與B⑦、A與B⑧、A與B⑨等處理。數(shù)據(jù)采用Excel和SAS軟件處理，對分化率和成苗率統(tǒng)計結果進行方差分析。

1.3.4 生根培養(yǎng)基對外植體生根的影響 待芽、苗生長到2～3 cm時，去掉多余的愈傷組織移至生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)14 d后統(tǒng)計生根率。生根率=生根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%。

2 結果與分析

2.1 基因型對油菜組織培養(yǎng)的影響

對F4和T15子葉進行相同條件下的愈傷誘導和愈傷分化培養(yǎng)，2周時統(tǒng)計愈傷誘導率，4～6周時統(tǒng)計分化率和成苗率。由表1可知，F(xiàn)4子葉誘導率和成苗率均高于T15；T15的分化率高于F4，但成苗率低于F4，F(xiàn)4具有較好的組織培養(yǎng)特性，可作為后繼研究的外植體供試品系。

2.2 不同培養(yǎng)基對油菜葉片愈傷組織分化的影響

F4第18、22天葉片的愈傷組織進行不同分化培養(yǎng)基的分化培養(yǎng)。本研究沒有對愈傷誘導培養(yǎng)進行優(yōu)化，而是針對分化率和成苗率進行篩選培養(yǎng)。由表2可知， 分化培養(yǎng)基B⑧與其他分化培養(yǎng)基分化效率進行差異顯著性分析，結果顯示苗齡18 d和22 d的葉片的分化率、成苗率均存在顯著性差異（P<0.05），B⑧分化效果最佳，芽、苗分化狀態(tài)好，玻璃化現(xiàn)象少； B⑧分化培養(yǎng)基下，F(xiàn)4第22天葉片分化效率最高達到75.2%，成苗率可達28.1%； 18 d和22 d葉片在B⑧分化培養(yǎng)基上最高成苗率分別為25.4%和28.1%，第22天葉片更適合組織培養(yǎng)。

2.3 不同培養(yǎng)基對油菜愈傷組織生根誘導的影響

將由F4第22天葉片分化的芽置于生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至14 d時統(tǒng)計生根情況結果見表3、圖1。由表3可知，在1/2 MS中添加1 mg/L IBA 的C④生根培養(yǎng)基中，生根率可達100%，生根較快，誘導的不定根也較多、較粗壯。不同的生根誘導培養(yǎng)基對幼苗和不定根的伸長也有較大的影響，C①和C⑤幾乎不生根，C③和C④都能有效誘導生根，但C④效果明顯好于C③，生根較快、較粗壯，C③蔗糖比例大于C④，可能在生根階段，降低蔗糖濃度，有利于生根誘導。

3 小結與討論

不同品系的同一類型外植體的愈傷組織誘導率和不定芽分化率均存在顯著差異（P<0.05），F(xiàn)4品系子葉誘導率可達98.3%，18 d和22 d葉片的誘導率為98.0%和98.6%，T15愈傷誘導率均低于這個水平，F(xiàn)4組織培養(yǎng)特性優(yōu)于T15。

本研究表明，4 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA搭配誘導芽苗分化的效果最佳，這與已往在蕓薹屬中，能分化出再生植株的培養(yǎng)基大多采用6-BA和NAA組合[14-16]的結果相似。6-BA濃度為4 mg/L時，芽分化多且很少出現(xiàn)苗玻璃化現(xiàn)象；高濃度6-BA導致“玻璃化”現(xiàn)象嚴重；濃度低時，芽分化率低。1/2 MS基本培養(yǎng)基中添加1 mg/L IBA時，其生根效果最好。不同的基本培養(yǎng)基對生根效率和長勢也存在較大影響，添加相同濃度和種類的激素，MS比B5培養(yǎng)基生根效果較好，MS基本培養(yǎng)基更適合于生根培養(yǎng)。不同苗齡的葉片直接影響愈傷的誘導率和分化率。對F4品系12、15、18和22 d苗齡的葉片進行再生試驗，結果表明，22 d的葉片愈傷誘導率和分化率最高。這樣取材時間比Hou等[5]、韓善華等[13]的縮短將近一半，不但節(jié)省了外植體的取材時間，而且可以獲得更高的成苗率。

參考文獻：

[1] 劉國紅，梁明祥，周詩雨，等.甘藍型油菜南鹽油1號不同外植體體系的比較研究[J].南京農業(yè)大學學報，2012，35（3）：42-46.

[2] KARTHA K K， GAMBORG O L， CONSTABEL F. In vitro plant formation from stem explants of rape（Brassica napus cv. Zephyr） [J]. Physiol，1974，31（3）：217-220.

[3] 韓德俊，曹 莉，袁本威，等.甘藍型油菜花莖高效再生體系研究[J].農業(yè)生物技術科學，2005，12（6）：86-88.

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[5] HOU B K， ZHOU Y H， WAN L H， et al. Chloroplast transformation in oilseed rape[J]. Transgenic Research，2003，12（1）：111-114.

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[10] 周吉源，程井辰，王家訓.油菜花序軸、葉片組織培養(yǎng)中形態(tài)發(fā)生的細胞組織學研究[J].武漢植物學研究，1988，6（1）：45-49.

[11] 潘 剛，石淑穩(wěn)，魏澤蘭，等.甘藍型冬性和半冬性油菜子葉高效快速芽體系的建立[J].華中農業(yè)大學學報，2004，26（3）：1-5.

[12] CHENG L， LI H P， QU B， et al. Chloroplast transformation of rapeseed（Brassica napus） by particle bombardment of cotyledons[J]. Plant Cell Rep，2010，29（4）：371-381.

[13] 韓善華，鄭國锠.油菜（Brassica napus L.） 葉片植株的再生[J]. 實驗生物學報，1983，16（1）：1-7.

[14] 王景雪，孫 毅.蕓薹屬（Brassica）植物的組織培養(yǎng)和基因轉化[J].山西農業(yè)大學學報，1996，16（3）：9-14.

[15] 王景雪， 孫 毅， 崔貴梅，等.在油菜組織培養(yǎng)中激素及基因型對下胚軸分化的影響[J].中國油料作物學報，2000，22（1）：11-14.

[16] 石淑穩(wěn)，周永明.甘藍型油菜下胚軸培養(yǎng)和高頻率芽再生技術的研究[J].中國油料作物學報，1998，20（2）：1-6.

2 結果與分析

2.1 基因型對油菜組織培養(yǎng)的影響

對F4和T15子葉進行相同條件下的愈傷誘導和愈傷分化培養(yǎng)，2周時統(tǒng)計愈傷誘導率，4～6周時統(tǒng)計分化率和成苗率。由表1可知，F(xiàn)4子葉誘導率和成苗率均高于T15；T15的分化率高于F4，但成苗率低于F4，F(xiàn)4具有較好的組織培養(yǎng)特性，可作為后繼研究的外植體供試品系。

2.2 不同培養(yǎng)基對油菜葉片愈傷組織分化的影響

F4第18、22天葉片的愈傷組織進行不同分化培養(yǎng)基的分化培養(yǎng)。本研究沒有對愈傷誘導培養(yǎng)進行優(yōu)化，而是針對分化率和成苗率進行篩選培養(yǎng)。由表2可知， 分化培養(yǎng)基B⑧與其他分化培養(yǎng)基分化效率進行差異顯著性分析，結果顯示苗齡18 d和22 d的葉片的分化率、成苗率均存在顯著性差異（P<0.05），B⑧分化效果最佳，芽、苗分化狀態(tài)好，玻璃化現(xiàn)象少； B⑧分化培養(yǎng)基下，F(xiàn)4第22天葉片分化效率最高達到75.2%，成苗率可達28.1%； 18 d和22 d葉片在B⑧分化培養(yǎng)基上最高成苗率分別為25.4%和28.1%，第22天葉片更適合組織培養(yǎng)。

2.3 不同培養(yǎng)基對油菜愈傷組織生根誘導的影響

將由F4第22天葉片分化的芽置于生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至14 d時統(tǒng)計生根情況結果見表3、圖1。由表3可知，在1/2 MS中添加1 mg/L IBA 的C④生根培養(yǎng)基中，生根率可達100%，生根較快，誘導的不定根也較多、較粗壯。不同的生根誘導培養(yǎng)基對幼苗和不定根的伸長也有較大的影響，C①和C⑤幾乎不生根，C③和C④都能有效誘導生根，但C④效果明顯好于C③，生根較快、較粗壯，C③蔗糖比例大于C④，可能在生根階段，降低蔗糖濃度，有利于生根誘導。

3 小結與討論

不同品系的同一類型外植體的愈傷組織誘導率和不定芽分化率均存在顯著差異（P<0.05），F(xiàn)4品系子葉誘導率可達98.3%，18 d和22 d葉片的誘導率為98.0%和98.6%，T15愈傷誘導率均低于這個水平，F(xiàn)4組織培養(yǎng)特性優(yōu)于T15。

本研究表明，4 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA搭配誘導芽苗分化的效果最佳，這與已往在蕓薹屬中，能分化出再生植株的培養(yǎng)基大多采用6-BA和NAA組合[14-16]的結果相似。6-BA濃度為4 mg/L時，芽分化多且很少出現(xiàn)苗玻璃化現(xiàn)象；高濃度6-BA導致“玻璃化”現(xiàn)象嚴重；濃度低時，芽分化率低。1/2 MS基本培養(yǎng)基中添加1 mg/L IBA時，其生根效果最好。不同的基本培養(yǎng)基對生根效率和長勢也存在較大影響，添加相同濃度和種類的激素，MS比B5培養(yǎng)基生根效果較好，MS基本培養(yǎng)基更適合于生根培養(yǎng)。不同苗齡的葉片直接影響愈傷的誘導率和分化率。對F4品系12、15、18和22 d苗齡的葉片進行再生試驗，結果表明，22 d的葉片愈傷誘導率和分化率最高。這樣取材時間比Hou等[5]、韓善華等[13]的縮短將近一半，不但節(jié)省了外植體的取材時間，而且可以獲得更高的成苗率。

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[15] 王景雪， 孫 毅， 崔貴梅，等.在油菜組織培養(yǎng)中激素及基因型對下胚軸分化的影響[J].中國油料作物學報，2000，22（1）：11-14.

[16] 石淑穩(wěn)，周永明.甘藍型油菜下胚軸培養(yǎng)和高頻率芽再生技術的研究[J].中國油料作物學報，1998，20（2）：1-6.

2 結果與分析

2.1 基因型對油菜組織培養(yǎng)的影響

對F4和T15子葉進行相同條件下的愈傷誘導和愈傷分化培養(yǎng)，2周時統(tǒng)計愈傷誘導率，4～6周時統(tǒng)計分化率和成苗率。由表1可知，F(xiàn)4子葉誘導率和成苗率均高于T15；T15的分化率高于F4，但成苗率低于F4，F(xiàn)4具有較好的組織培養(yǎng)特性，可作為后繼研究的外植體供試品系。

2.2 不同培養(yǎng)基對油菜葉片愈傷組織分化的影響

F4第18、22天葉片的愈傷組織進行不同分化培養(yǎng)基的分化培養(yǎng)。本研究沒有對愈傷誘導培養(yǎng)進行優(yōu)化，而是針對分化率和成苗率進行篩選培養(yǎng)。由表2可知， 分化培養(yǎng)基B⑧與其他分化培養(yǎng)基分化效率進行差異顯著性分析，結果顯示苗齡18 d和22 d的葉片的分化率、成苗率均存在顯著性差異（P<0.05），B⑧分化效果最佳，芽、苗分化狀態(tài)好，玻璃化現(xiàn)象少； B⑧分化培養(yǎng)基下，F(xiàn)4第22天葉片分化效率最高達到75.2%，成苗率可達28.1%； 18 d和22 d葉片在B⑧分化培養(yǎng)基上最高成苗率分別為25.4%和28.1%，第22天葉片更適合組織培養(yǎng)。

2.3 不同培養(yǎng)基對油菜愈傷組織生根誘導的影響

將由F4第22天葉片分化的芽置于生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至14 d時統(tǒng)計生根情況結果見表3、圖1。由表3可知，在1/2 MS中添加1 mg/L IBA 的C④生根培養(yǎng)基中，生根率可達100%，生根較快，誘導的不定根也較多、較粗壯。不同的生根誘導培養(yǎng)基對幼苗和不定根的伸長也有較大的影響，C①和C⑤幾乎不生根，C③和C④都能有效誘導生根，但C④效果明顯好于C③，生根較快、較粗壯，C③蔗糖比例大于C④，可能在生根階段，降低蔗糖濃度，有利于生根誘導。

3 小結與討論

不同品系的同一類型外植體的愈傷組織誘導率和不定芽分化率均存在顯著差異（P<0.05），F(xiàn)4品系子葉誘導率可達98.3%，18 d和22 d葉片的誘導率為98.0%和98.6%，T15愈傷誘導率均低于這個水平，F(xiàn)4組織培養(yǎng)特性優(yōu)于T15。

本研究表明，4 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA搭配誘導芽苗分化的效果最佳，這與已往在蕓薹屬中，能分化出再生植株的培養(yǎng)基大多采用6-BA和NAA組合[14-16]的結果相似。6-BA濃度為4 mg/L時，芽分化多且很少出現(xiàn)苗玻璃化現(xiàn)象；高濃度6-BA導致“玻璃化”現(xiàn)象嚴重；濃度低時，芽分化率低。1/2 MS基本培養(yǎng)基中添加1 mg/L IBA時，其生根效果最好。不同的基本培養(yǎng)基對生根效率和長勢也存在較大影響，添加相同濃度和種類的激素，MS比B5培養(yǎng)基生根效果較好，MS基本培養(yǎng)基更適合于生根培養(yǎng)。不同苗齡的葉片直接影響愈傷的誘導率和分化率。對F4品系12、15、18和22 d苗齡的葉片進行再生試驗，結果表明，22 d的葉片愈傷誘導率和分化率最高。這樣取材時間比Hou等[5]、韓善華等[13]的縮短將近一半，不但節(jié)省了外植體的取材時間，而且可以獲得更高的成苗率。

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