(湖北省荊州市婦幼保健院藥劑科，湖北 荊州 434020)

鎖陽(yáng) Cynomorium songaricum Rupr.為鎖陽(yáng)科鎖陽(yáng)屬多年生肉質(zhì)寄生草本植物，藥用部位是全草，又名“不老藥”“銹鐵棒”“沙漠人參”等，藥食兩用，主要分布于土壤缺乏有機(jī)質(zhì)而富含鹽分的荒漠地帶，主產(chǎn)于甘肅、新疆、青海、寧夏、內(nèi)蒙古等地[1]。鎖陽(yáng)中，所含兒茶素具有提高免疫功能、抗氧化等活性；沒(méi)食子酸具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤作用；原兒茶酸具有增加冠脈流量、降低心肌耗氧量的作用，在體外具有明顯抑制血小板聚集的活性和抗菌活性[2-3]。筆者以兒茶素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，參考文獻(xiàn)[4-6]，采用 L9(34)正交試驗(yàn)法優(yōu)選提取工藝，確定最佳提取條件，旨在為鎖陽(yáng)藥材的合理開(kāi)發(fā)和充分利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters 600型高效液相色譜儀，Waters 996 photodiode Array Detector二極管矩陣檢測(cè)器，Millennium 32色譜工作站(美國(guó)Waters)；Metter AE 240型十萬(wàn)分之一電子天平；SK5200H型超聲波提取器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；Anke TGL-16B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。兒茶素對(duì)照品(批號(hào)為110877-200001)，沒(méi)食子酸對(duì)照品(批號(hào)為110831-200302)，原兒茶酸對(duì)照品(批號(hào)為110809-200503)，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；乙腈為色譜純(天津四友)，水為滅菌注射用水，其余試劑均為分析純；鎖陽(yáng)藥材及飲片均經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院馬志鋼教授鑒定為 Cynomorium songaricum Rupr.。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定方法建立

2.1.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Hypersil ODS C18柱(250 mm ×4.6 mm，2.5 μm)；流動(dòng)相:乙腈-水-36%乙酸(8∶92∶0.1)；流速:1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng):258.7 nm；柱溫:室溫；進(jìn)樣量:20 μL。外標(biāo)法定量，在此條件下，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2對(duì)照品溶液制備

稱取兒茶素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸對(duì)照品適量，精密稱定，置同一10 mL容量瓶中，加滅菌注射用水適量，超聲10 min，加水至刻度，配制成含兒茶素0.118 g/L、沒(méi)食子酸0.126 g/L、原兒茶酸0.147 g/L的混合對(duì)照品溶液。另取兒茶素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸對(duì)照品適量，加滅菌注射用水，分別制成含兒茶素4.945 1 g/L、沒(méi)食子酸0.208 g/L、原兒茶酸0.040 g/L的對(duì)照品貯備液。

2.1.3方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:精密吸取混合對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 mL，分別置5 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，依次取稀釋后的混合對(duì)照品溶液及未稀釋的混合對(duì)照品溶液20 μL進(jìn)樣，按擬訂色譜條件測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)、峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并回歸處理，得回歸方程，兒茶素 Y=82 466.81 X+281.83，r=0.999 9；沒(méi)食子酸Y=886294.46X+1485.33，r=0.9996；原兒茶酸 Y=2136116.67X+5 884.29，r=0.999 8。結(jié)果表明，對(duì)照品進(jìn)樣量?jī)翰杷卦?.047～1.510 μg范圍內(nèi)、沒(méi)食子酸在 0.050～1.613 μg范圍內(nèi)、原兒茶酸在0.059～1.882 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):分別精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20 μL。結(jié)果峰面積的 RSD兒茶素為0.93%(n=6)，沒(méi)食子酸為0.86%(n=6)，原兒茶酸為1.12%(n=6)。

重復(fù)性試驗(yàn):按樣品含量測(cè)定方法，取同一批樣品(東風(fēng)場(chǎng)區(qū)飲片)6份，按最佳工藝提取，按樣品含量測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定。結(jié)果兒茶素的含量為10.25 mg/g，RSD為0.79%(n=6)；沒(méi)食子酸的含量為0.403 mg/g，RSD為0.60%(n=6)；原兒茶酸的含量為0.078 mg/g，RSD為1.12%(n=6)。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，避光放置，分別在制備后0，2，4，6，8，10 h 時(shí)依法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果峰面積的 RSD 兒茶素為1.01%(n=6)，沒(méi)食子酸為0.77%(n=6)，原兒茶酸為0.69%(n=6)，表明供試品溶液在避光條件下10 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):取已知含量(兒茶素10.25 mg/g，沒(méi)食子酸0.403 mg/g，原兒茶酸0.078 mg/g)的樣品(東風(fēng)場(chǎng)區(qū)飲片)1.0 g，精密稱定，共取6份，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入兒茶素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸對(duì)照品儲(chǔ)備液各2.0 mL，另精密加入注射用水4 mL，按供試品溶液制備方法制備溶液并測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果兒茶素平均為回收率為98.56%，RSD=1.3%(n=6)；沒(méi)食子酸平均回收率為100.53%，RSD=1.1%(n=6)；原兒茶酸平均回收率為98.34%，RSD=1.6%(n=6)。

2.2 提取工藝優(yōu)化

以溶劑種類(lèi)(因素A)、溶劑用量(因素B)、提取時(shí)間(因素C)為考察因素，設(shè)置因素水平，見(jiàn)表1。采用 L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)并進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時(shí)，除表3所列的顯著性差異外，原兒茶酸(Ⅱ)含量的方差分析結(jié)果無(wú)顯著性差異。可見(jiàn)，各因素對(duì)3種成分提取的影響大小不同，對(duì)沒(méi)食子酸依次為B＞A＞C，對(duì)原兒茶酸依次為A＞C＞B，對(duì)兒茶素依次為A＞C＞B。溶劑種類(lèi)比較時(shí)，雖然兒茶素在50%的甲醇提取物中含量最高，但分離困難、峰形很差，而水提物中沒(méi)食子酸、原兒茶酸含量最高；溶劑用量比較時(shí)，容積用10 mL時(shí)，原兒茶酸、兒茶素含量最高；提取時(shí)間比較時(shí)，提取30min時(shí)原兒茶酸、兒茶素含量最高。因此，確定最佳工藝條件為B1C3A1，即將10 mL水加入2 g鎖陽(yáng)粉中，超聲提取30min。

表1 因素水平表

2.3 樣品含量測(cè)定

取鎖陽(yáng)粉末(過(guò)40目篩)約2.0 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，精密加入滅菌注射用水10mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30min，放冷，再稱定質(zhì)量，離心(12 000 r/min)5 min，上清液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，置棕色瓶中，即得。依上述方法制備7批供試品溶液，分別取配制好的對(duì)照品溶液和供試品溶液，精密吸取20 μL進(jìn)樣，用峰面積按外標(biāo)法計(jì)算鎖陽(yáng)藥材、飲片中兒茶素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸的含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

2.4 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

取3批樣品，按優(yōu)選工藝提取，結(jié)果見(jiàn)表5。RSD＜2.5%，表明優(yōu)選的提取工藝條件基本穩(wěn)定。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg/g，n=2)

表5 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(mg/g，n=3)

3 討論

在流動(dòng)相的優(yōu)化中，選用了乙腈-水系統(tǒng)的不同配比(25∶75，40∶60，10∶90，18∶82，5∶95，3∶97，4∶96，8∶92)，選用了甲醇-水系統(tǒng)的不同配比(20∶80，50∶50)，選用了乙腈-水-36%乙酸系統(tǒng)的不同配比(5∶95∶0.3，5∶95∶0.1，8∶92∶0.1，7∶93∶0.1，6∶94∶0.2，8∶92∶0.2)進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)的降低，兒茶素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸的保留時(shí)間增加，乙酸的加入使峰形更好。當(dāng)乙腈-水-36%乙酸為8∶92∶0.1時(shí)能夠獲得好的分離效果和短的分離時(shí)間，故選擇此流動(dòng)相系統(tǒng)作為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。

由于兒茶素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸的含量差異較大，綜合評(píng)價(jià)時(shí)用3種成分的含量之和作為評(píng)價(jià)指標(biāo)不夠科學(xué)、準(zhǔn)確。9次正交試驗(yàn)中，兒茶素的平均含量為5.939 mg/g，沒(méi)食子酸的平均含量是0.207 mg/g，原兒茶酸的平均含量是0.033 mg/g。用3種成分的含量之和作為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，更多地反映了含量較大的兒茶素的含量變化，有時(shí)會(huì)掩蓋含量較小的沒(méi)食子酸和原兒茶酸的含量變化。如何更好、更科學(xué)、更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)和優(yōu)化多種成分的提取工藝，有待進(jìn)一步研究。

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