王娜娜，薛培鳳，耿 婕，魏 慧，李鳳英，張冬艷

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

蒙藥玉簪花是百合科植物玉簪 Hosta plantaginea（Lam．）Aschers．的干燥花，又名內(nèi)消花、白鶴花、白玉簪等，是蒙醫(yī)專用、常用藥材之一，具有悠久的蒙醫(yī)臨床用藥歷史和確切的療效。蒙藥典籍《蒙藥正典》中已有記載?！吨腥A本草》（蒙藥卷）記載其性寒，味澀、苦，效軟、柔、稀，具有清熱、解毒、止咳、利咽喉之功效，主治咽喉腫痛、音啞、肺熱、毒熱。但有關(guān)玉簪花及其制品中多糖的檢測(cè)方法及含量的影響因素，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)采用單因素及正交試驗(yàn)對(duì)玉簪花總多糖提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選，并建立了測(cè)定玉簪花多糖含量的方法，為玉簪花的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用及其多糖的生物活性研究奠定基礎(chǔ)[1]。

1 儀器與試藥

AL204型電子天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）；TU－1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；BFX5－320型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（白洋離心機(jī)廠）；IKARV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)）；HH－S型數(shù)顯恒溫油浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；BGZ－146型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）。玉簪花藥材于2013年2月購(gòu)自內(nèi)蒙古藥材公司，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)喬俊纏教授鑒定為百合科植物玉簪H．plantaginea的花；葡萄糖(天津市福晨化學(xué)試劑廠)，無(wú)水乙醇(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)，苯酚（天津永晟精細(xì)化工有限公司），石油醚(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)，濃硫酸（天津大茂化學(xué)試劑廠），以上試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 提取工藝單因素考察[2]

2．1．1 提取溫度

將玉簪花藥材粉碎過(guò)40目篩，稱取1．0 g干燥的玉簪花藥材粉末5份，精密稱定，分別以石油醚30 mL回流脫脂3 h，揮去石油醚。脫脂后的藥材分別在室溫條件下以水浸泡2 h，料液比1 ∶20，在不同溫度（60，70，80，90，100 ℃）下提取 2 h，提取次數(shù)為1次，過(guò)濾去渣，向提取液中加無(wú)水乙醇至含醇體積為80%，沉淀多糖，放入冰箱，靜置過(guò)夜，離心。將沉淀的多糖溶于蒸餾水，采用苯酚硫酸法測(cè)定其含量。在上述條件下，每份平行操作2次，結(jié)果取2次測(cè)定的平均值，考察提取溫度對(duì)總多糖得率的影響[3]。結(jié)果見(jiàn)表1。

2．1．2 提取時(shí)間

方法同 2．1．1 項(xiàng)，提取溫度為 90 ℃ ，在不同提取時(shí)間（1，2，3，4，5 h）內(nèi)各提取1次，測(cè)定其含量，考察提取時(shí)間對(duì)總多糖得率的影響[4]。結(jié)果見(jiàn)表1。

2．1．3 料液比

方法同 2．1．1項(xiàng)，提取時(shí)間為 3 h，提取溫度為 90℃，在不同料液比（1 ∶10，1 ∶20，1 ∶30，1 ∶40，1 ∶50）條件下各提取 1 次，測(cè)定其含量，考察料液比對(duì)總多糖得率的影響。結(jié)果見(jiàn)表1。

2．1．4 提取次數(shù)[5]

方法同 2．1．1項(xiàng)，按料液比 1∶20，提取溫度為 90℃，提取時(shí)間為3 h，在不同提取次數(shù)的條件下，測(cè)定其含量，考察提取次數(shù)對(duì)總多糖得率的影響。結(jié)果見(jiàn)表1。

2．2 提取工藝正交試驗(yàn)[6－7]

在2．1項(xiàng)下單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，結(jié)合文獻(xiàn)，以料液比（因素A）、提取時(shí)間（因素 B）、提取溫度（因素 C）、提取次數(shù)（因素 D）為最終因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素3水平，進(jìn)行 L9(34)4因素3水平正交試驗(yàn)，以玉簪花總多糖得率為考察指標(biāo)。因素水平表見(jiàn)表2(正交試驗(yàn)重復(fù)做2次，結(jié)果取2次測(cè)定的平均值)。正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析結(jié)果見(jiàn)表3和表4?？梢?jiàn)，因素D對(duì)提取工藝有顯著性影響（P＜0．05），各因素的影響大小順序依次為 D＞A＞B＞C，即提取次數(shù)＞料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度。結(jié)合單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)結(jié)果，得出各因素的最佳水平依次為A3B3C3D2。根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際考慮，B選擇 B2。綜合選擇，最佳提取工藝條件為A3B2C1D2，即料液比 1∶30，提取時(shí)間 3 h，提取溫度 80℃，提取次數(shù)3次。

表1 玉簪花多糖提取工藝單因素考察結(jié)果

表2 提取工藝正交試驗(yàn)因素水平表

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2．3 含量測(cè)定及方法學(xué)考察[8]

2．3．1 對(duì)照品溶液制備

稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖10．01 mg，精密稱定，加水溶解并定容于100 mL容量瓶中，搖勻，即得葡萄糖對(duì)照品貯備液(0．1 g ／L)[9]。

2．3．2 測(cè)定波長(zhǎng)選擇[10]

采用苯酚－硫酸顯色法，分別精密吸取對(duì)照品及供試品溶液1 mL，加入5%苯酚溶液 1 mL，充分搖勻，迅速貼壁加入濃硫酸5 mL，靜置 30 min。同法制得空白對(duì)照溶液，在紫外分光光度計(jì)200～600 nm波長(zhǎng)范圍掃描，作圖。確定本試驗(yàn)玉簪花藥材中總多糖的測(cè)定波長(zhǎng)為488 nm。

2．3．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取葡萄糖對(duì)照品貯備液 0．2，0．3，0．4，0．6，0．7，0．8 mL，置 6 個(gè)干燥試管中，分別加水補(bǔ)至 1．0 mL，在488 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y＝8．903 6 X＋0．041 7，r＝0．999 4（n＝6）。結(jié)果表明，葡萄糖溶液質(zhì)量濃度在 0．02～0．08 g／L 范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液，分別依法測(cè)定6次。結(jié)果吸光度的 RSD＝0．17%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一樣品6份，依法制備供試品溶液并測(cè)定含量。結(jié)果的 RSD＝2．96%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，于制備后6 d內(nèi)每隔1 h測(cè)定 1次吸光值，共測(cè)定 6次。結(jié)果的 RSD＝1．21%（n＝6），表明供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取6份玉簪花藥材粉末各 0．5 g，精密稱定，脫脂提取、沉淀多糖后，定容于50 mL容量瓶中，吸取1 mL，置25 mL容量瓶中，加入已知質(zhì)量濃度的葡萄糖對(duì)照品溶液，用蒸餾水定容。按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下苯酚－硫酸法分別測(cè)定吸光度，根據(jù)葡萄糖的檢出量計(jì)算回收率。結(jié)果葡萄糖平均回收率為98．26% ，RSD ＝2．05% （n＝6）。

2．3．4 樣品含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱量玉簪花粉末1．0 g，對(duì)原料脫脂后，室溫條件下浸泡2 h，根據(jù)正交試驗(yàn)最佳提取條件（即料液比為1∶30，80℃提取3次，每次3 h）提取，合并提取液，減壓濃縮，向濃縮液中加無(wú)水乙醇至含醇80%，沉淀多糖，放入冰箱(4℃)，靜置過(guò)夜；離心分離，沉淀多糖全部溶于蒸餾水，定容，即得供試品溶液。采用苯酚－硫酸法，測(cè)定其含量，結(jié)果為3．65%。

表5 最佳提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

2．4 最佳提取工藝驗(yàn)證

稱取玉簪花粉末20 g，以正交試驗(yàn)優(yōu)選的最佳提取工藝參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，應(yīng)用優(yōu)化后工藝條件進(jìn)行提取，按擬定含量測(cè)定方法依次測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表5?？梢?jiàn)，多糖得率平均值比單因素試驗(yàn)的得率高，且 3次得率基本接近，說(shuō)明用優(yōu)化后的工藝條件重復(fù)性好。

3 討論

多糖是一類天然大分子化合物，由10個(gè)以上至成千個(gè)單糖脫水形成的天然高分子聚合物，是構(gòu)成生命的分子基礎(chǔ)之一。多糖易溶于水，不溶于乙醇等有機(jī)溶劑，最常見(jiàn)的提取方法是水提醇沉，沉淀干燥后即為粗多糖。大量的藥理及臨床研究表明，多糖具有抗癌、增強(qiáng)免疫力等作用，對(duì)于預(yù)防和治療包括癌癥在內(nèi)的多種疾病都具有巨大的潛力，因此多糖的研究目前已成為關(guān)注的焦點(diǎn)。百合科植物多糖的研究在近年才逐漸開(kāi)展起來(lái)，提取條件已比較清楚，可考慮進(jìn)一步放大處理。但對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究仍然非常有限，大多數(shù)已報(bào)道的百合科植物多糖的結(jié)構(gòu)信息不夠詳盡，高級(jí)結(jié)構(gòu)的研究還是空白，故需作進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析。有關(guān)其藥理作用方面的研究較多，但沒(méi)有涉及進(jìn)一步的作用機(jī)理及功能結(jié)構(gòu)。從應(yīng)用研究的角度來(lái)看，百合科植物多糖具有很多藥理作用，極有潛力開(kāi)發(fā)為新型的藥物和保健品。百合科植物種類很多，分布也很廣，資源極其豐富，多糖含量高，因此對(duì)百合科植物多糖進(jìn)行廣泛深入地研究，具有巨大的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。

本試驗(yàn)采取單因素試驗(yàn)及4因素3水平正交試驗(yàn)方案對(duì)玉簪花多糖的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。由正交試驗(yàn)結(jié)果分析可知，提取次數(shù)是最主要的影響因素，其次是料液比，提取時(shí)間及提取溫度影響不顯著。工藝放大試驗(yàn)研究表明，該工藝條件簡(jiǎn)單、穩(wěn)定可行，為有效開(kāi)發(fā)利用玉簪花多糖奠定了基礎(chǔ)。

采用苯酚－硫酸法測(cè)定玉簪花多糖的含量，通過(guò)石油醚脫脂，揮干后水提，再以乙醇醇沉分離多糖成分。方法學(xué)考察結(jié)果表明，采用該法測(cè)定玉簪花多糖的含量，方法簡(jiǎn)單、可靠、重復(fù)性好、顯色穩(wěn)定。

綜上所述，玉簪花多糖尚待進(jìn)一步研究，通過(guò)基礎(chǔ)的最佳提取方法確定和含量測(cè)定，為進(jìn)一步研究多糖的純化方法及藥理活性奠定了基礎(chǔ)。訊作者，(電話)0471 －6653146（電子信箱）xpfdc＠ vip．sina．com。

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