戴 軍

（湖南省溆浦縣中醫(yī)院，湖南 溆浦 419300）

膚美康膠囊是由地黃、柴胡、當(dāng)歸、牡丹皮、山藥、茯苓、山茱萸等中藥加工制成的內(nèi)服膠囊劑，處方源于臨床經(jīng)驗方，具有疏肝養(yǎng)陰、補血化瘀的功效，用于治療黃褐斑、雀斑及色素沉著等癥。為保證該制劑的內(nèi)在質(zhì)量，筆者采用薄層色譜法對其中的當(dāng)歸、牡丹皮、山藥、茯苓進(jìn)行了定性鑒別，并采用高效液相色譜(HPLC)法對牡丹皮中丹皮酚的含量進(jìn)行測定[1－4]，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀，包括LC－20AT輸液泵、SPDM20AVP檢測器、LCsolution工作站（日本）；9906A型超聲儀（上海）；硅膠G（青島海洋化工廠）。丹皮酚、阿魏酸對照品（供含量測定用，批號分別為 110708－200506和 110773－200611），山藥、茯苓對照藥材（批號分別為121137－200402和121117－200605），均由中國藥品生物制品檢定所提供；膚美康膠囊（湖南溆浦縣中醫(yī)院，批號為 20120821，20130109，20130918）；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 薄層色譜鑒別

當(dāng)歸：取本品內(nèi)容物15 g，加1%碳酸氫鈉溶液50 mL，超聲處理 10 min，離心，取上清液，用稀鹽酸調(diào)節(jié) pH至 2～3，用乙醚振搖提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺當(dāng)歸的陰性樣品，同法制備成陰性對照品溶液。再取阿魏酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典》（一部）》附錄Ⅵ B]試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠 G薄層板上，以苯 －乙酸乙酯－甲酸（4∶1∶0．1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視[1，5]。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，而缺當(dāng)歸的陰性對照品溶液則無此斑點 (圖1 A)。

牡丹皮：取本品內(nèi)容物10 g，加乙醚 40 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液揮干，殘渣加丙酮0．5 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺牡丹皮的陰性樣品，同法制備成陰性對照品溶液。另取丹皮酚對照品，加丙酮制成每1 mL含1 mg溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB]試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷 －乙酸乙酯（3∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%酸性三氯化鐵乙醇溶液（5%三氯化鐵乙醇溶液10 mL，加鹽酸2 mL，混勻），在105℃加熱至斑點顯色清晰[1－2]。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，而缺牡丹皮的陰性對照品溶液則無此斑點 (圖1 B)。

山藥：取本品內(nèi)容物 25 g，加二氯甲烷 30 mL，加熱回流2 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加二氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺山藥的陰性樣品，同法制備成陰性對照品溶液。另取山藥對照藥材5 g，同法制備成對照藥材溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典（一部）》附錄Ⅵ B]試驗，吸取上述 3種溶液各 5 μL，分別點于同一硅膠 G薄層板上，以乙酸乙酯－甲醇－濃氨試液（9 ∶1 ∶0．5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 10% 磷鉬酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰[1，6－7]。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，而缺山藥的陰性對照品溶液則無此斑點 (圖1 C)。

茯苓：取本品內(nèi)容物8 g，加乙醚30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液揮干，殘渣加無水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺茯苓的陰性樣品，同法制備成陰性對照品溶液。另取茯苓對照藥材4 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典（一部）附錄ⅥB]試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙醚 －石油醚（60～90℃，1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視[1，8－9]。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光主斑點，而缺茯苓的陰性對照品溶液則無此斑點(圖1 D)。

圖1 薄層色譜圖

2．2 丹皮酚含量測定

2．2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱： DiamonsilTMC18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 －水（80 ∶20）；檢測波長：274 nm；柱溫：室溫；流速：1．0 mL／min。按丹皮酚峰計算，理論板數(shù)不少于4 000。

2．2．2 溶液制備

稱取丹皮酚對照品10．45 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液（質(zhì)量濃度209 μg／mL）；精密吸取對照品貯備液 5 mL，置 50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含丹皮酚20．9 μg的對照品溶液。取本品內(nèi)容物，研細(xì)，混勻，取約0．5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率 33 kHz）45 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，用微孔濾膜（0．45 μm）濾過，取續(xù)濾液即得供試品溶液[2，7－8]。取除牡丹皮外的其余處方量藥材，同樣品制備方法制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2．2．3 方法學(xué)考察

干擾試驗：分別精密吸取 2．2．2項下 3種溶液各 10 μL，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣測定。色譜圖見圖2。供試品溶液色譜中，在與丹皮酚對照品溶液色譜相應(yīng)位置上有色譜峰，而陰性對照品溶液色譜中則無此峰，說明陰性無干擾。

線性關(guān)系考察：精密吸取質(zhì)量濃度為20．9 μg／mL的丹皮酚對照品溶液，分別進(jìn)樣 2．0，5．0，10．0，20．0，30．0，40．0 μL，測定峰面積，以進(jìn)樣量(μg，X)為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸(n＝6)，得回歸方程 Y＝4．759 729×106X －3．798×103，r＝0．999 7（n ＝6）。結(jié)果表明，丹皮酚進(jìn)樣量在 0．041 8 ～0．836 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖2 高效液相色譜圖

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定其峰面積積分值。結(jié)果的 RSD為0．23%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：分別精密吸取同一供試品（批號為20120821）溶液 10 μL，于 0，2，4，6，8，10，12，14，16，24 h 時進(jìn)樣，測定其峰面積積分值。結(jié)果的 RSD為0．93%(n＝10)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取同一批樣品（批號為 20120821）6份，按供試品溶液制備方法平行處理并測定。結(jié)果丹皮酚平均含量為2．007 9 mg／g，RSD 為 0．73% （n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：稱取已知含量為 2．007 9 mg／g（批號為20120821）的樣品細(xì)粉約 0．25 g，精密稱定，共 6份，分別置具塞錐形瓶中，精密加入丹皮酚對照品溶液貯備液 1．9，1．9，2．4，2．4，2．9，2．9 mL，按供試品溶液制備方法處理并測定含量，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 丹皮酚加樣回收試驗結(jié)果(n＝6)

2．2．4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液。精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件依法進(jìn)樣測定，計算丹皮酚的含量。結(jié)果批號為20120821，20130109，20130918的樣品中每粒含丹皮酚分別為 0．9980，1．0238，1．0617 mg。

3 討論

膚美康膠囊處方共有12味中藥。本次質(zhì)量控制研究中，對處方中的地黃、柴胡、當(dāng)歸、牡丹皮、山藥、茯苓、山茱萸等進(jìn)行了薄層色譜鑒別，在柴胡、地黃、山茱萸的薄層鑒別方法摸索中，雖然供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，但陰性對照有干擾，故最終確定了當(dāng)歸、牡丹皮、山藥、茯苓4味藥材專屬性強的薄層鑒別方法。

該制劑中牡丹皮用量較大，成分清楚，且有丹皮酚對照品，故決定采用HPLC法測定制劑中丹皮酚的含量。方法學(xué)考察結(jié)果表明，HPLC法重復(fù)性好、回收率高、快速簡便、準(zhǔn)確可行，可作為該制劑的定量方法。供試品溶液的制備中，為保證樣品中丹皮酚的充分提取，對提取時間和提取功率進(jìn)行了考察（時間為15，30，45，60 min，功率為 200，250，300 W），結(jié)果功率 250 W、頻率33 kHz、時間45 min時即能將樣品中丹皮酚提取完全。

所建立的方法能很好鑒別該制劑中的當(dāng)歸、牡丹皮、山藥、茯苓，測定牡丹皮中丹皮酚的含量，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

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